背景[1-3]
人細(xì)胞周期素D1(CYCLIN-D1)ELISA試劑盒用于體外定量檢測(cè)血清、血漿、組織勻漿及相關(guān)液體樣本中人細(xì)胞周期素D1(CYCLIN-D1)的含量。
實(shí)驗(yàn)原理：試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。往預(yù)先包被人細(xì)胞周期素D1(CYCLIN-D1)捕獲抗體的包被微孔中，依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的檢測(cè)抗體，經(jīng)過溫育并徹底洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的人細(xì)胞周期素D1(CYCLIN-D1)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測(cè)定吸光度（OD值），計(jì)算樣品濃度。
人細(xì)胞周期素D1(CYCLIN-D1)ELISA試劑盒
樣本要求：
1.血清：將收集于血清分離管的全血標(biāo)本在室溫放置2小時(shí)或4℃過夜，然后1000×g離心20分鐘，取上清即可，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
2.血漿：用EDTA或肝素作為抗凝劑采集標(biāo)本，并將標(biāo)本在采集后的30分鐘內(nèi)于2-8℃1000×g離心15分鐘，取上清即可檢測(cè)，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
3.組織勻漿：用預(yù)冷的PBS(0.01M,pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細(xì)胞會(huì)影響測(cè)量結(jié)果），稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對(duì)應(yīng)體積的PBS（一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對(duì)應(yīng)9mL的PBS，具體體積可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)調(diào)整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。為了進(jìn)一步裂解組織細(xì)胞，可以對(duì)勻漿液進(jìn)行超聲破碎，或反復(fù)凍融。最后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘，取上清檢測(cè)。
4.細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本：請(qǐng)1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測(cè)，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
操作步驟:
1.從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。
2.設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL；
3.樣本孔中加入待測(cè)樣本50μL；空白孔不加。
4.除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測(cè)抗體100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。
5.棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（350μL），靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機(jī)洗板）。
6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
7.每孔加入終止液50μL，15min內(nèi)，在450nm波長處測(cè)定各孔的OD值。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算
以所測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品的OD值為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上或用相關(guān)軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得到直線回歸方程，將樣品的OD值代入方程，計(jì)算出樣品的濃度。
應(yīng)用[4][5]
用于STAT3、VEGF和CyclinD1在人胃癌組織中表達(dá)及意義的研究
應(yīng)用免疫組化技術(shù)對(duì)胃癌中STAT3、VEGF、CyclinD1的表達(dá)水平及意義進(jìn)行研究,探討胃正常組織、胃良性病變組織和胃癌中STAT3、VEGF、CyclinD1表達(dá)水平的差異及與胃癌組織類型、浸潤程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期等臨床病理特征的關(guān)系,以及三者之間的相關(guān)性,為采取有效方法阻斷腫瘤轉(zhuǎn)移、提高療效、估計(jì)預(yù)后提供重要的理論依據(jù)。
材料和方法:取自手術(shù)標(biāo)本及胃鏡活檢標(biāo)本共90例,其中65例胃癌組織,25例胃良性病變組織,30例胃正常組織,其中30例胃正常組織取自胃癌手術(shù)標(biāo)本兩斷端,經(jīng)病理證實(shí)無癌細(xì)胞浸潤或癌前病變。術(shù)前均未進(jìn)行化療或放療,臨床資料完整。應(yīng)用免疫組化S-P法,檢測(cè)胃正常組織、胃良性病變組織和胃癌組織中STAT3、VEGF和CyclinD1的表達(dá)水平,并觀察它們與胃癌組織類型、浸潤程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期等臨床病理特征的關(guān)系,以及三者之間的相關(guān)性,統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)采用χ2檢驗(yàn)或Fisher檢驗(yàn),相關(guān)分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)。結(jié)果P＜0.05為有顯著性差異。P＜0.01為有極顯著性差異。
結(jié)果:1.在胃癌組織中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子（STAT3）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、細(xì)胞周期素D1（CyclinD1）表達(dá)陽性率顯著高于胃良性病變組織及胃正常組織（P＜0.01）。胃正常組織和胃良性病變組織中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子（STAT3）、血管內(nèi)皮因子（VEGF）、細(xì)胞周期素D1（CyclinD1）表達(dá)陽性率無明顯差別（P＞0.05）。
2. 胃癌組織中STAT3表達(dá)陽性率在低分化組為89.74%明顯高于高、中分化組的40.00%、57.14%（P＜0.05）,高、中分化組無明顯差別（P＞0.05）;已穿破漿膜組為92.86%明顯高于未穿破漿膜組的62.16%（P＜0.05）;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組為85.37%明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的58.33%（P＜0.05）;III、IV期組為93.75%和92.31%明顯高于I、II期組的60.00%和62.50%（P＜0.05）,I、II期組無明顯差別（P＞0.05）,III、IV期組無明顯差別（P＞0.05）;性別、組織學(xué)類型之間無顯著性差異（P＞0.05）。
3.胃癌組織中VEGF表達(dá)陽性率在低分化組為92.31%明顯高于高、中分化組的60.00%和80.95%（P＜0.05）,高、中分化組無明顯差別（P＞0.05）;已穿破漿膜組為92.86%明顯高于未穿破漿膜組的81.08%（P＜0.05）;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組為90.24%明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的79.17%（P＜0.05）;III、IV期組為93.75%和92.31%明顯高于I、II期組的80.00%和81.25%（P＜0.05）,I、II期組無明顯差別（P＞0.05）,III、IV期組無明顯差別（P＞0.05）;性別、組織學(xué)類型之間無顯著性差異（P＞0.05）。
參考文獻(xiàn)
[1]Specific function of STAT3,SOCS1,and SOCS3 in the regulation of proliferation and survival of classical Hodgkin lymphoma cells[J].DanielaBaus,EdithPfitzner.Int.J.Cancer.2006(6)
[2]Circulating VEGF Levels in the Serum of Gastric Cancer Patients:Correlation With Pathological Variables,Patient Survival,and Tumor Surgery[J].Anastasios J.Karayiannakis,Konstantinos N.Syrigos,Alexandros Polychronidis,Andrew Zbar,Gregory Kouraklis,Constantinos Simopoulos,Gabriel Karatzas.Annals of Surgery.2002(1)
[3]Angiogenesis as a target for gastric cancer[J].Yoshihiro Kakeji,Yoshihiko Maehara,Yasushi Sumiyoshi,Shinya Oda,Yasunori Emi.Surgery.2002(1)
[4]Signaling through the JAK/STAT pathway,recent advances and future challenges[J].T Kisseleva,S Bhattacharya,J Braunstein,C.W Schindler.Gene.2002(1)
[5]王紅鈺.STAT3、VEGF和CyclinD1在人胃癌組織中表達(dá)及意義的研究[D].河北醫(yī)科大學(xué),2007.