背景[1-3]
人抗脫氧核糖核蛋白抗體(DNP-AB)ELISA試劑盒用于體外定量檢測血清、血漿、組織勻漿及相關(guān)液體樣本中抗脫氧核糖核蛋白抗體(DNP-AB)的含量。
實驗原理
人抗脫氧核糖核蛋白抗體(DNP-Ab)ELISA試劑盒是采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。往預(yù)先包被人抗脫氧核糖核蛋白抗體(DNP-Ab)捕獲抗體的包被微孔中，依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的檢測抗體，經(jīng)過溫育并徹底洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的人抗脫氧核糖核蛋白抗體(DNP-Ab)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。
人抗脫氧核糖核蛋白抗體(DNP-Ab)ELISA試劑盒
樣本處理要求
1.血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過程中如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。
2.血漿：應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)該再次離心。
3.尿液：用無菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。
4.細(xì)胞培養(yǎng)上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。檢測細(xì)胞內(nèi)的成份時，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度達(dá)到100萬/ml左右。通過反復(fù)凍融，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。
操作步驟
1.從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。
2.設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL；
3.樣本孔中加入待測樣本50μL；空白孔不加。
4.除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。
5.棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（350μL），靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機(jī)洗板）。
6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
7.每孔加入終止液50μL，15min內(nèi)，在450nm波長處測定各孔的OD值。
實驗結(jié)果計算
以所測標(biāo)準(zhǔn)品的OD值為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上或用相關(guān)軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得到直線回歸方程，將樣品的OD值代入方程，計算出樣品的濃度。
應(yīng)用[4][5]
用于SmD1蛋白表達(dá)與免疫原性研究及其抗體檢測初步應(yīng)用研究
采用基因工程技術(shù),獲取原核表達(dá)和真核表達(dá)的SmmDl重組蛋白,觀察兩者免疫原性和抗原性的差異。探索SmD1蛋白在免疫過量的情況下,誘導(dǎo)抗dsDNA抗體和其它抗核抗體產(chǎn)生的可能性,為尋找系統(tǒng)性紅斑狼瘡的啟動原及發(fā)病機(jī)理提供實驗依據(jù)；最后,以昆蟲細(xì)胞表達(dá)的SmD1蛋白為抗原,研制抗SmD1抗體測定酶聯(lián)免疫試劑,并進(jìn)行初步的應(yīng)用評價。
方法：以化學(xué)合成方法獲得目的基因,經(jīng)PCR擴(kuò)增,測序正確后,分別克隆到原核表達(dá)載體pET-21a和真核表達(dá)載體pFastBacTM1上,成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-21a-SmD1和pFastBacTM1-SmD1。
（1）原核表達(dá)：將質(zhì)粒pET-21a-SmD1轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21,選取陽性克隆,16℃低溫條件下,1mmol IPTG誘導(dǎo)表達(dá),SDS-PAGE電泳鑒定重組蛋白,Ni-NTA親和層析柱純化。
（2）真核表達(dá)：將質(zhì)粒pFastBacTM1-SmD1轉(zhuǎn)化到DH10Bac,藍(lán)白斑篩選陽性克隆,獲得重組穿梭載體Bacmid,轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞Sf9,接著進(jìn)行重組桿狀病毒的擴(kuò)增,目的蛋白表達(dá),SDS-PAGE電泳鑒定重組蛋白,Ni-NTA親和層析柱純化,Western blot驗證。
（3）免疫原性研究：將原核表達(dá)蛋白和真核表達(dá)蛋白以皮下多點(diǎn)注射方式免疫4周齡Balb/c雌鼠,每隔兩周免疫一次,共免疫三次,在第0周、2周、5周和9周,取小鼠血清,ELISA檢測抗dsDNA抗體IgG,LIA法檢測ANA譜,第9周處死,取脾臟T淋巴細(xì)胞,ELISPOT檢測分泌IFN-y T淋巴細(xì)胞的頻數(shù),流式細(xì)胞術(shù)檢測脾T淋巴細(xì)胞亞群CD3、CD4和CD8的比例及CD3+CD4+/CD4+CD8+的比值。
（4）建立檢測抗SmD1抗體的間接ELISA方法,檢測553例各類型自身免疫性疾病患者血清,其中230例SLE。
結(jié)果：經(jīng)DNA序列分析和雙酶切鑒定證實了重組質(zhì)粒pET-21a-SmD1和pFastBacl-SmD1構(gòu)建正確,并且分別在大腸桿菌BL21和桿狀病毒／昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)（AcMNPV/Sf9）表達(dá)成功,獲得目的蛋白。經(jīng)Ni-NTA親和層析柱高效分離帶HIS標(biāo)簽的重組蛋白SmD1,純度大于95%。經(jīng)Bradford法測定,大腸桿菌表達(dá)的重組蛋白濃度為0.62mg/mL,昆蟲細(xì)胞表達(dá)的重組蛋白濃度為0.908mg/mL。免疫原性研究發(fā)現(xiàn),同時期,昆蟲細(xì)胞Sf9表達(dá)的SmD1蛋白誘導(dǎo)抗Sm抗體和抗dsDNA抗體滴度比大腸桿菌BL21表達(dá)的蛋白誘導(dǎo)的抗體滴度高。
Sf9表達(dá)的SmD1蛋白誘導(dǎo)抗dsDNA抗體滴度于第二次免疫后1周（第5周）達(dá)到頂峰,之后逐漸下降,而BL21表達(dá)的SmD1蛋白誘導(dǎo)的抗dsDNA抗體滴度在9周之內(nèi),滴度隨時間的延長不斷增加?？筪sDNA抗體在各組中的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。同時,SmD1重組蛋白也會誘導(dǎo)IgG抗SSA/60抗體、抗SSA/52抗體、抗SSB抗體、抗Scl-70抗體和抗U1-snRNP抗體的產(chǎn)生。在SmDl免疫過量的情況下,原核蛋白免疫組、真核蛋白免疫組的CD4+/CD8+平衡失調(diào),與對照組比較,CD3+CD4+值下降,CD3+CD8+值升高,CD3+CD4+/CD3+CD8+比值下降。
參考文獻(xiàn)
[1]Several Affinity Tags Commonly Used in Chromatographic Purification[J].Xinyu Zhao,Guoshun Li,Shufang Liang,Kiran Kumar Doddapaneni.Journal of Analytical Methods in Chemistry.2013
[2]The Role of Microparticles in the Pathogenesis of Rheumatoid Arthritis and Systemic Lupus Erythematosus[J].J.R.Dye,A.J.Ullal,D.S.Pisetsky.Scand J Immunol.2013(2)
[3]Systemic lupus erythematosus and infections:Clinical importance of conventional and upcoming biomarkers[J].S.Sciascia,L.Ceberio,C.Garcia-Fernandez,D.Roccatello,Y.Karim,M.J.Cuadrado.Autoimmunity Reviews.2012(2)
[4]Systemic lupus erythematosus associated with ANCA-associated vasculitis:an overlapping syndrome?[J].B.Hervier,M.Hamidou,J.Haroche,C.Durant,A.Mathian,Z.Amoura.Rheumatology International.2012(10)
[5]鐘運(yùn)華.SmD1蛋白表達(dá)與免疫原性研究及其抗體檢測初步應(yīng)用[D].廣州中醫(yī)藥大學(xué),2014.