背景[1-3]
人抗中性粒細胞抗體(ANA)ELISA試劑盒用于體外定量檢測血清、血漿、組織勻漿及相關液體樣本中人抗中性粒細胞抗體（ANA）的含量。
實驗原理
人抗中性粒細胞抗體(ANA)ELISA試劑盒采用間接法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。往預先包被人抗中性粒細胞抗體（ANA）捕獲抗原的包被微孔中，依次加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體，經(jīng)過溫育并徹底洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的人抗中性粒細胞抗體（ANA）呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。
人抗中性粒細胞抗體(ANA)ELISA試劑盒
樣品收集、處理及保存方法：
1.血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，操作過程中避免任何細胞刺激，收集血液后，3000轉離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。
2.血漿：edta、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000轉離心30分鐘取上清。
3.細胞上清液：3000轉離心10分鐘去除顆粒和聚合物。
4. 組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000轉離心10分鐘取上清。
操作步驟
1.從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。
2.設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL；
3.樣本孔中加入待測樣本50μL；空白孔不加。
4.除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。
5.棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（350μL），靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板5次（也可用洗板機洗板）。
6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
7.每孔加入終止液50μL，15min內(nèi)，在450nm波長處測定各孔的OD值。
[實驗結果計算]
以所測標準品的OD值為橫坐標，標準品的濃度值為縱坐標，在坐標紙上或用相關軟件繪制標準曲線，并得到直線回歸方程，將樣品的OD值代入方程，計算出樣品的濃度。
應用[4][5]
用于抗中性粒細胞胞漿抗體與炎癥性腸病關聯(lián)性探討研究
針對出現(xiàn)消化道病癥且ANCA陽性人群的分布狀況及臨床特征探討分析,旨在揭示ANCA對IBD的早期預警價值。
方法:收集整理2019年1月至2021年12月于消化科就診且行ANCA檢測的患者病歷資料2795例,檢測結果陽性者設為ANCA陽性組,參照陽性組的性別年齡構成比在同期健康體檢人群中分層抽樣568例進行ANCA檢測設為健康對照組,并與消化科就診人群進行對比;就診人群中ANCA檢測結果陰性者全部納入陰性對照組,分析ANCA陽性組的臨床特征及分布特征,并與陰性對照組進行對比分析;計數(shù)資料用率或百分比表示,組間率的比較采用χ~2檢驗,以P＜0.01為差異有顯著性統(tǒng)計學意義。
結果:1.消化科三年共檢測ANCA 2795例,其中ANCA陽性442例,陽性檢出率為15.81%（442/2795）,明顯高于健康對照組的陽性檢出率3.17%（18/568）,χ~2=63.927,P＜0.01,差異有顯著性統(tǒng)計學意義。
2.442例ANCA陽性組中,核周型ANCA（perinuclear ANCA,p ANCA）289例,占65.38%（289/442）,胞漿型ANCA（cytoplasmic ANCA,c ANCA）153例,占34.62%（153/442）,p ANCA陽性率顯著高于c ANCA,χ~2=83.692,P＜0.01,差異有顯著性統(tǒng)計學意義。
3.442例ANCA陽性組臨床癥狀中腹痛伴黏液膿血便、腹痛伴腹脹、腹瀉、惡心伴嘔吐的發(fā)生率較高,分別為23.53%（104/442）、21.49%（95/442）、13.35%（59/442）、7.24%（32/442）,其中腹痛伴黏液膿血便、腹痛伴腹脹、腹瀉的發(fā)生率明顯高于陰性對照組的2.17%（51/2353）、7.86%（185/2353）、6.93%（163/2353）,差異有統(tǒng)計學意義。
4.ANCA陽性組中有257例行腸鏡及病理檢查,經(jīng)臨床綜合評判符合IBD診斷的有136例,占比52.92%（136/257）;ANCA陰性組中有716例行腸鏡及病理檢查,經(jīng)臨床綜合評判符合IBD診斷的有49例,占比6.84%（49/716）,ANCA陽性組IBD確診率顯著高于陰性對照組,χ~2=260.727,P＜0.01,差異有顯著性統(tǒng)計學意義。結論:消化科就診人群ANCA陽性率顯著高于健康體檢人群,以p ANCA為主,且ANCA陽性人群IBD確診率顯著高于陰性人群。ANCA對IBD有預警價值,對出現(xiàn)消化道癥狀尤其是腹痛伴黏液膿血便、腹痛伴腹脹、腹瀉的人群及早檢測ANCA有利于IBD的早期發(fā)現(xiàn)。
參考文獻
[1]Antibody subtypes and titers predict clinical outcomes in ANCA-associated vasculitis[J].Muhammad Aljuhani,Devan Makati,Abigail Hoff,Jesse Thompson,Bethany Pellegrino,Khaled Shawwa,Rebecca Schmidt,Dinesh Kannabhiran.Rheumatology International.2021(5)
[2]Assessment of clinical activity and severity using serum ANCA and ASCA antibodies in patients with ulcerative colitis[J].Pang Yanhua,Ruan Huijie,Wu Dongfang,Lang Yanfei,Sun Ke,Xu Cuiping.Allergy,Asthma＆Clinical Immunology.2020(1)
[3]Anti-neutrophil cytoplasmic antibodies（ANCA）:Antigen interactions and downstream effects.[J].Sundqvist Martina,Gibson Kristen M,Bowers Sarah M,Niemietz Iwona,Brown Kelly L.Journal of leukocyte biology.2020(2)
[4]The diagnostic role and clinical association of serum proteinase 3 anti-neutrophil cytoplasmic antibodies in Chinese patients with inflammatory bowel disease.[J].Xu Yan,Xu Fei,Li Wenjie,Li Mengting,Dong Shouquan,Zhang Yupeng,Norman Gary L,Zhao Qiu,Liu Lan.Scandinavian journal of gastroenterology.2020(7)
[5]牛穎穎.抗中性粒細胞胞漿抗體與炎癥性腸病關聯(lián)性探討[D].承德醫(yī)學院,2022.