背景[1-3]
人環(huán)磷酸鳥苷(CGMP)ELISA KIT用于體外定量檢測血清、血漿或其它相關(guān)生物液體中環(huán)磷酸鳥苷(CGMP)的含量。
檢測原理:本試劑盒采用雙抗體夾心ELISA法。用抗環(huán)磷酸鳥苷(CGMP)抗體包被于酶標板上，實驗時樣品（或標準品）中的環(huán)磷酸鳥苷(CGMP)會與包被抗體結(jié)合，游離的成分被洗去，然后依次加入生物素化的抗環(huán)磷酸鳥苷(CGMP)抗體，HRP-鏈霉親和素結(jié)合物,最后加入單組份TMB底物液。TMB在辣根過氧化物酶的催化下呈現(xiàn)藍色，加終止液后變成黃色。用酶標儀在450nm波長處測OD值，環(huán)磷酸鳥苷(CGMP)濃度與OD450值之間呈正比，通過繪制標準曲線計算出樣品中環(huán)磷酸鳥苷(CGMP)的濃度。
人環(huán)磷酸鳥苷(CGMP)ELISA KIT
樣品收集:
1.血清：全血樣品于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測，收集血液的試管應(yīng)為一次性的無熱原，無內(nèi)毒素試管。
2.血漿：抗凝劑推薦使用EDTA-Na2，樣品采集后30分鐘內(nèi)于1000×g離心15分鐘，取上清即可檢測。避免使用溶血，高血脂樣品。
3.組織勻漿：用預(yù)冷的PBS(0.01M,pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細胞會影響測量結(jié)果），稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應(yīng)體積的PBS（一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對應(yīng)9mL的PBS，具體體積可根據(jù)實驗需要適當調(diào)整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。為了進一步裂解組織細胞，可以對勻漿液進行超聲破碎，或反復(fù)凍融。最后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘，取上清檢測。
4.細胞培養(yǎng)上清：取細胞培養(yǎng)上清于1000×g離心20分鐘，除去雜質(zhì)及細胞碎片。取上清檢測。
操作步驟：
1．使用前，將所有試劑充分混勻。不要使液體產(chǎn)生大量的泡沫，以免加樣時加入大量的氣泡，產(chǎn)生加樣上的誤差。
2．根據(jù)待測樣品數(shù)量加上標準品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個標準品和空白孔建議做復(fù)孔。每個樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定，能使用復(fù)孔的盡量做復(fù)孔。
3．加入稀釋好后的標準品50ul于反應(yīng)孔、加入待測樣品50ul于反應(yīng)孔內(nèi)。立即加入50ul的生物素標記的抗體。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37℃溫育45分鐘。
4．甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作4次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數(shù)增加一次。
5．每孔加入100ul的親和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻，37℃溫育30分鐘。
6．甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作4次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數(shù)增加一次。
7．每孔加入底物A、B各50ul，輕輕振蕩混勻，37℃溫育5分鐘。避免光照。
8．取出酶標板，迅速加入50ul終止液，加入終止液后應(yīng)立即測定結(jié)果。
9．在450nm波長處測定各孔的OD值。
應(yīng)用[4][5]
用于乙型肝炎患者血清5羥色胺與環(huán)磷酸鳥苷含量檢測及意義研究
通過對急、慢性乙型肝炎患者和正常對照組血清中CGMP、5-HT、ALT、AST水平的檢測和相關(guān)性的分析，進一步探討Ⅰ型超敏反應(yīng)在乙型肝炎發(fā)病機制中的作用及相關(guān)性。
方法：選擇45例急、慢性乙型肝炎患者及30例正常對照組，采用酶聯(lián)免疫吸附實驗—雙抗體夾心法，檢測患者和對照組血清中CGMP與5-HT濃度；應(yīng)用全自動生化分析儀同步檢測血清中ALT與AST水平，并與血清中CGMP與5-HT濃度做相關(guān)性分析。
結(jié)果：①急性乙型肝炎患者血清5—HT和CGMP含量明顯高于對照組；②39例慢性乙型肝炎患者血清CGMP和5—HT含量均明顯高于正常對照組，其中慢性重度組升高明顯，其次為中度組和輕度組；③患者血清中CGMP和5—HT含量與血清ALT，AST水平呈正相關(guān)。
結(jié)論：①急、慢性乙型肝炎患者血清中CGMP、5—HT水平可反應(yīng)肝臟損害程度；②檢測急、慢性乙型肝炎患者血清中CGMP、5—HT水平對判斷患者病情和預(yù)后有一定參考價值；③結(jié)合本課題組的其他研究結(jié)果，進一步佐證了Ⅰ型超敏反應(yīng)參與了乙型肝炎患者的肝細胞免疫損傷過程的可能性。
參考文獻
[1]Melatonin enhances antioxidative enzyme gene expression（CAT,GPx,SOD）,prevents their UVR‐induced depletion,and protects against the formation of DNA damage（8‐hydroxy‐2’‐deoxyguanosine）in ex vivo human skin[J].Tobias W.Fischer,Konrad Kleszczyński,Lena H.Hardkop,Nathalie Kruse,Detlef Zillikens.J.Pineal Res..2012(3)
[2]cGMP and cyclic nucleotide-gated channels participate in mouse sperm capacitation[J].Abraham Cisneros-Mejorado,Daniel P.Sánchez Herrera.FEBS Letters.2011(2)
[3]Increased levels of oxidants and reduced antioxidants in semen of infertile men with varicocele[J].Mohamed Ahmed Abd-Elmoaty,Ramadan Saleh,Rakesh Sharma,Ashok Agarwal.Fertility and Sterility.2010(4)
[4]Impact of estrogenic compounds on DNA integrity in human spermatozoa:Evidence for cross-linking and redox cycling activities[J].L.E.Bennetts,G.N.De Iuliis,B.Nixon,M.Kime,K.Zelski,C.M.McVicar,S.E.Lewis,R.J.Aitken.Mutation Research-Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis.2008(1)
[5]陳寧.乙型肝炎患者血清5羥色胺與環(huán)磷酸鳥苷含量檢測及意義[D].延邊大學(xué),2007.