競爭法

人環(huán)磷酸鳥苷(CGMP)ELISA KIT采用雙抗體夾心ELISA法。用抗環(huán)磷酸鳥苷(CGMP)抗體包被于酶標(biāo)板上，實(shí)驗(yàn)時(shí)樣品（或標(biāo)準(zhǔn)品）中的環(huán)磷酸鳥苷(CGMP)會(huì)與包被抗體結(jié)合，游離的成分被洗去，然后依次加入生物素化的抗環(huán)磷酸鳥苷(CGMP)抗體，HRP-鏈霉親和素結(jié)合物,最后加入單組份TMB底物液。TMB在辣根過氧化物酶的催化下呈現(xiàn)藍(lán)色，加終止液后變成黃色。用酶標(biāo)儀在450nm波長處測(cè)OD值，環(huán)磷酸鳥苷(CGMP)濃度與OD450值之間呈正比，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中環(huán)磷酸鳥苷(CGMP)的濃度。

人人環(huán)磷酸鳥苷(CGMP)ELISA KIT用于體外定量檢測(cè)血清、血漿或其它相關(guān)生物液體中環(huán)磷酸鳥苷(CGMP)的含量。本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測(cè)定標(biāo)本中人環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)水平。用純化的環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)捕獲抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被的微孔中依次加入環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)，再與HRP標(biāo)記的檢測(cè)抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測(cè)定吸光度（OD值），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)含量。1. 血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過程中如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。 2. 血漿：應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)該再次離心。 3. 尿液：用無菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。胸腹水、腦脊液參照實(shí)行。 4. 細(xì)胞培養(yǎng)上清：檢測(cè)分泌性的成份時(shí)，用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的成份時(shí)，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度達(dá)到100萬/ml左右。通過反復(fù)凍融，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。 5. 組織標(biāo)本：切割標(biāo)本后，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。?biāo)本融化后仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。分裝后一份待檢測(cè)，其余冷凍備用。 6. 標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若不能馬上進(jìn)行試驗(yàn)，可將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。 7. 不能檢測(cè)含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。1. 標(biāo)準(zhǔn)品的加樣：設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL。 2. 加樣：分別設(shè)空白孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）、待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測(cè)樣品10μl（樣品最終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。 3. 加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑100μl，空白孔除外。 4. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育60分鐘。 5. 配液：將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用。 6. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。 7. 顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘。 8. 終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。 9. 測(cè)定：以空白孔調(diào)零，450nm波長依序測(cè)量各孔的吸光度（OD值）。 測(cè)定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。可檢測(cè)樣本中人的cGMP，且與其類似物無明顯交叉反應(yīng)。環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）是一種環(huán)狀核苷酸，來源于三磷酸鳥苷（GTP）。它最可能的作用機(jī)制是激活細(xì)胞內(nèi)的蛋白激酶，以應(yīng)對(duì)膜滲透性肽類激素與細(xì)胞外表面的結(jié)合。鳥苷酸環(huán)化酶（GC）催化cGMP的合成。這種酶將GTP轉(zhuǎn)換為cGMP。肽類激素，如心房鈉尿素激活膜結(jié)合的GC，而可溶性GC（sGC）通常被一氧化氮激活以刺激cGMP的合成。sGC可被ODQ（1H-[1,2,4]噁二唑并[4,3-a]喹喔啉-1-酮）抑制。cGMP是離子通道傳導(dǎo)性、糖原分解和細(xì)胞凋亡的常見調(diào)節(jié)劑。它還能放松平滑肌組織。在血管中，血管平滑肌的放松導(dǎo)致血管擴(kuò)張和血流量增加。cGMP是眼睛中光傳導(dǎo)的二級(jí)信使。在哺乳動(dòng)物眼睛的光感受器中，光的存在激活了磷酸二酯酶，使cGMP降解。光感受器中的鈉離子通道是cGMP門控的，因此cGMP的降解導(dǎo)致鈉離子通道關(guān)閉，從而導(dǎo)致光感受器質(zhì)膜的超極化，最終導(dǎo)致視覺信息被傳送到大腦。cGMP還被視為介導(dǎo)了皮質(zhì)第五層錐體細(xì)胞頂端樹突對(duì)semaphorin-3A（Sema3a）的吸引力的開啟。這種吸引是由存在于頂端樹突中的可溶性鳥苷酸環(huán)化酶（SGC）水平增加所介導(dǎo)的。SGC產(chǎn)生cGMP，導(dǎo)致一連串的化學(xué)激活，從而導(dǎo)致對(duì)Sema3a的吸引。軸突中沒有SGC會(huì)導(dǎo)致Sema3a的排斥。這一策略確保了錐體神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)極化，并發(fā)生在胚胎發(fā)育期。cGMP和cAMP一樣，在嗅覺受體接受氣味輸入時(shí)被合成。cGMP產(chǎn)生緩慢，比cAMP具有更持久的生命力，這使它與細(xì)胞對(duì)氣味刺激的長期反應(yīng)有關(guān)，如長期癡呆。