背景^[1-3]

小鼠胚胎干細(xì)胞系MESPU30(M30)ELISA KIT用于體外定量檢測(cè)血清、血漿或其它相關(guān)生物液體中小鼠胚胎干細(xì)胞系MESPU30(M30)的含量。

檢測(cè)原理:本試劑盒采用雙抗體夾心ELISA法。用抗小鼠胚胎干細(xì)胞系MESPU30(M30)抗體包被于酶標(biāo)板上，實(shí)驗(yàn)時(shí)樣品（或標(biāo)準(zhǔn)品）中的小鼠胚胎干細(xì)胞系MESPU30(M30)會(huì)與包被抗體結(jié)合，游離的成分被洗去，然后依次加入生物素化的抗小鼠胚胎干細(xì)胞系MESPU30(M30)抗體，HRP-鏈霉親和素結(jié)合物,最后加入單組份TMB底物液。TMB在辣根過(guò)氧化物酶的催化下呈現(xiàn)藍(lán)色，加終止液后變成黃色。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)OD值，小鼠胚胎干細(xì)胞系MESPU30(M30)濃度與OD450值之間呈正比，通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中小鼠胚胎干細(xì)胞系MESPU30(M30)的濃度。

小鼠胚胎干細(xì)胞系MESPU30(M30)ELISA KIT

樣品收集:

1.血清：全血樣品于室溫放置2小時(shí)或4℃過(guò)夜后于1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測(cè)，收集血液的試管應(yīng)為一次性的無(wú)熱原，無(wú)內(nèi)毒素試管。

2.血漿：抗凝劑推薦使用EDTA-Na2，樣品采集后30分鐘內(nèi)于1000×g離心15分鐘，取上清即可檢測(cè)。避免使用溶血，高血脂樣品。

3.組織勻漿：用預(yù)冷的PBS(0.01M,pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細(xì)胞會(huì)影響測(cè)量結(jié)果），稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對(duì)應(yīng)體積的PBS（一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對(duì)應(yīng)9mL的PBS，具體體積可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)調(diào)整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。為了進(jìn)一步裂解組織細(xì)胞，可以對(duì)勻漿液進(jìn)行超聲破碎，或反復(fù)凍融。最后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘，取上清檢測(cè)。

4.細(xì)胞培養(yǎng)上清：取細(xì)胞培養(yǎng)上清于1000×g離心20分鐘，除去雜質(zhì)及細(xì)胞碎片。取上清檢測(cè)。

操作步驟：

1．使用前，將所有試劑充分混勻。不要使液體產(chǎn)生大量的泡沫，以免加樣時(shí)加入大量的氣泡，產(chǎn)生加樣上的誤差。

2．根據(jù)待測(cè)樣品數(shù)量加上標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和空白孔建議做復(fù)孔。每個(gè)樣品根據(jù)自己的數(shù)量來(lái)定，能使用復(fù)孔的盡量做復(fù)孔。

3．加入稀釋好后的標(biāo)準(zhǔn)品50ul于反應(yīng)孔、加入待測(cè)樣品50ul于反應(yīng)孔內(nèi)。立即加入50ul的生物素標(biāo)記的抗體。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37℃溫育45分鐘。

4．甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作4次。如果用洗板機(jī)洗滌，洗滌次數(shù)增加一次。

5．每孔加入100ul的親和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻，37℃溫育30分鐘。

6．甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作4次。如果用洗板機(jī)洗滌，洗滌次數(shù)增加一次。

7．每孔加入底物A、B各50ul，輕輕振蕩混勻，37℃溫育5分鐘。避免光照。

8．取出酶標(biāo)板，迅速加入50ul終止液，加入終止液后應(yīng)立即測(cè)定結(jié)果。

9．在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。

結(jié)果判斷與分析：

1、儀器值：于波長(zhǎng)450nm的酶標(biāo)儀上讀取各孔的OD值

2、以吸光度OD值為縱坐標(biāo)（Y），相應(yīng)的指標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)（X），做得相應(yīng)的曲線，樣品的含量可根據(jù)其OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出相應(yīng)的濃度,再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。

應(yīng)用^[4][5]

用于小鼠胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)及神經(jīng)分化的研究

1．剪刀切割結(jié)合針頭擠壓小鼠胎兒組織能有效獲得均勻、大小適中并容易貼壁生長(zhǎng)的小組織塊。將這些組織塊培養(yǎng)48h，大量的梭形細(xì)胞從貼壁小組織塊的邊緣游離出的，細(xì)胞密度大，細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，很快形成原代小鼠胎兒成纖維細(xì)胞（MEF）單層。MEF用5μg／ml的絲裂霉素處理2.5-4h，10μg／ml的絲裂霉素處理1-4h或20μg／ml的絲裂霉素處理1-2.5h均可有效抑制其分裂，并保持細(xì)胞的正?；盍?；用14、21、28GRAY的γ射線處理，亦可有效抑制MEF的分裂，保持細(xì)胞的正?；盍?。

2．小鼠ES細(xì)胞解凍后，在飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系用含LIF（1000U／ml）的完全培養(yǎng)液培養(yǎng)48h時(shí)，ES細(xì)胞形成邊界清晰光滑的克隆，克隆內(nèi)細(xì)胞排列緊密，難以辯認(rèn)單個(gè)細(xì)胞，克隆邊緣未見(jiàn)分化細(xì)胞；此時(shí)Oct-4細(xì)胞表達(dá)強(qiáng)烈的Oct-4-GFP綠色熒光，RT-PCR檢測(cè)到細(xì)胞有高水平的Oct-4 mRNA，堿性磷酸酶AKP反應(yīng)結(jié)果呈強(qiáng)陽(yáng)性，表明細(xì)胞處于良好的未分化形態(tài)。如果在無(wú)飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系培養(yǎng)48h，ES細(xì)胞出現(xiàn)了不同分化程度的克隆形態(tài)，表明飼養(yǎng)層能較好地控制ES細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)分化的發(fā)生。

3．將在飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系中已培養(yǎng)2-3代的ES細(xì)胞接種于有飼養(yǎng)層及預(yù)鋪了0.1％明膠（無(wú)飼養(yǎng)層）的96孔板中培養(yǎng)，在培養(yǎng)液中添加1000，1500，2000IU／ml的LIF能顯著提高ES細(xì)胞的陽(yáng)性度（有飼養(yǎng)層培養(yǎng)：17.80±3.26，19.58±3.19，21.8±3.17 vs 2.69±0.26；無(wú)飼養(yǎng)層培養(yǎng)：14.14±2.35，17.87±2.38，19.21±2.92 vs 0.016±0.0005，p＜0.01）及克隆形成率（有飼養(yǎng)層培養(yǎng)：29.1％，31.8％，33.5％vs 6.5％：無(wú)飼養(yǎng)層培養(yǎng)：24.7％，27.8％，31.2％vs 0.8％，p＜0.01）；但不同濃度LIF之間的陽(yáng)性度及克隆形成率差異不顯著（p＞0.05）。當(dāng)不添加LIF時(shí)，飼養(yǎng)層培養(yǎng)法能顯著地地提高ES細(xì)胞的AKP陽(yáng)性度及克隆形成率（2.69±0.26 vs 0.016±0.0005；6.5％vs 0.8％，p＜0.01）。說(shuō)明飼養(yǎng)層細(xì)胞在ES細(xì)胞的分化抑制中有一定作用，而起主導(dǎo)作用的是外源LIF。

4．培養(yǎng)液種類及添加谷氨酰胺、丙酮酸鈉和非必需氨基酸對(duì)ES細(xì)胞體外培養(yǎng)的效果影響較小，而培養(yǎng)用水和血清品質(zhì)對(duì)ES細(xì)胞體外培養(yǎng)的效果影響較大。Milli-Q水經(jīng)亞沸處理能顯著提高ES細(xì)胞保持未分化狀態(tài)的能力，優(yōu)質(zhì)胎牛血清能提高ES的AKP陽(yáng)性度和克隆形成率。

參考文獻(xiàn)

[1]Leukaemia inhibitory factor is identical to the myeloid growth factor human interleukin for DA cells.Moreau J F,Donaldson D D,Bennett F,et al.Nature.1988

[2]A strain-independent postnatal neurodegeneration in mice lacking the EGF receptor.Sibilia M,Steinbach JP,Stingl L,et al.EMBO Journal.1998

[3]CNS stem cells:where’s the biology（a.k.a.beef）.Weiss S,van der Kooy D.Journal of Neurobiology.1998

[4]An activity gradient of decapentaplegic is necessary for the specification of dorsal pattern elements in the Drosophila embryo.Wharton KA,Ray RP and Gelbart WM.Development.1993

[5]蒙超衡.小鼠胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)及神經(jīng)分化的研究[D].廣西大學(xué),2004.