背景^[1-3]

Beta-TC-6（小鼠胰島素瘤胰島β細(xì)胞）來源于轉(zhuǎn)基因小鼠中生長的一個胰腫瘤(胰島素瘤)，這種小鼠攜帶了大鼠胰島素Ⅱ基因啟動子調(diào)控的SV40早期基因的假基因結(jié)構(gòu)。Beta-TC-6細(xì)胞包含大量的胰島素和小量的胰高血糖素及生長抑素；Beta-TC-6細(xì)胞能響應(yīng)葡萄糖而分泌胰島素。

Beta-TC-6（小鼠胰島素瘤胰島β細(xì)胞）

細(xì)胞特性

1）來源：胰島素瘤

2）形態(tài)：上皮細(xì)胞樣，貼壁生長，少量懸浮。

3）含量：>1x106細(xì)胞數(shù)

4）規(guī)格：T25瓶或者1mL凍存管包裝

Beta-TC-6（小鼠胰島素瘤胰島β細(xì)胞）培養(yǎng)步驟：

1）準(zhǔn)備DMEM(含1.5g/LNaHCO3）培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，15%；雙抗1%。

注意事項：

1.Beta-TC-6細(xì)胞生長緩慢，這些細(xì)胞從冷凍保存中恢復(fù)需要幾天的時間。開始時通常具有少量可存活的漂浮細(xì)胞，其最終會形成簇并粘附在培養(yǎng)瓶底部，它們成簇地連接并形成堆積細(xì)胞的島嶼。細(xì)胞不會完全百分之百融合，培養(yǎng)物上會粘附可存活的漂浮細(xì)胞，可通過溫和離心保留。在添加細(xì)胞前，培養(yǎng)基至少要提前15-30分鐘平衡溫度和PH。

2.該細(xì)胞在DMEM(含1.5g/LNaHCO3)培養(yǎng)基中生長良好，大部分品牌的DMEM含有較高濃度的NaHCO3（3.7g/L），若使用DMEM（3.7g/LNaHCO3）培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞時需要提高CO2濃度（7%-10%）。

2）培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。

Beta-TC-6（小鼠胰島素瘤胰島β細(xì)胞）細(xì)胞處理：

凍存細(xì)胞的復(fù)蘇：

將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含4-6mL完全培養(yǎng)基的離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。然后將細(xì)胞懸液加入含6-8ml完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶（或皿）中37℃培養(yǎng)過夜。第二天顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況和細(xì)胞密度。

細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)70%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.收集：將培養(yǎng)瓶中的懸浮的細(xì)胞收集到離心管中。用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。由于細(xì)胞貼壁不牢PBS潤洗后細(xì)胞會脫落所以PBS也要回收到離心管中。

2.加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53mMEDTA于培養(yǎng)瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL）置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘（難消化的細(xì)胞可以適當(dāng)延長消化時間），然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入3-4ml含10%FBS的培養(yǎng)基來終止消化。

3.將收集到的懸浮細(xì)胞、pbs清洗液中的細(xì)胞和消化下來的貼壁細(xì)胞以1000rpml離心5min，棄去上清，補加1-2mL培養(yǎng)液后重懸混勻后將細(xì)胞懸液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照說明書要求配置的新的完全培養(yǎng)基以保持細(xì)胞的生長活力，后續(xù)傳代根據(jù)實際情況按1:2~1:5的比例進(jìn)行。

3）細(xì)胞凍存:收到細(xì)胞后建議在培養(yǎng)前3代時凍存一批細(xì)胞種子以備后續(xù)實驗使用。

應(yīng)用^[4][5]

Beta-TC-6（小鼠胰島素瘤胰島β細(xì)胞）可以用于骨鈣素對脂毒性Beta-TC-6細(xì)胞胰島素分泌障礙的影響及其機制研究

研究過表達(dá)成骨細(xì)胞胰島素受體對成骨細(xì)胞分化及骨鈣素表達(dá)的影響,進(jìn)一步探討成骨細(xì)胞分泌的骨鈣素能否改善脂毒性引起的Beta-TC-6細(xì)胞胰島素分泌障礙及其可能的機制。

方法:1.實驗設(shè)計:本研究的重點是“骨鈣素—胰島素環(huán)路”,選用的細(xì)胞為小鼠成骨前體細(xì)胞MC3T3-E1和小鼠胰島素瘤細(xì)胞Beta-TC-6。實驗分為兩部分,部分研究過表達(dá)MC3T3-E1細(xì)胞Ins R基因,探討其對糖脂毒性成骨分化障礙的影響。第二部分研究成骨細(xì)胞分泌的骨鈣素以及外源性骨鈣素能否促進(jìn)Beta-TC-6細(xì)胞胰島素的合成與釋放,改善β細(xì)胞葡萄糖刺激的胰島素分泌(GSIS)功能,并進(jìn)行機制探討。

2. 應(yīng)用慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染方法過表達(dá)MC3T3-E1細(xì)胞胰島素受體(Ins R)基因,探討其對糖脂毒性成骨細(xì)胞分化障礙及骨鈣素表達(dá)的影響;進(jìn)一步收集分化后的條件培養(yǎng)基干預(yù)Beta-TC-6細(xì)胞,Western blot、q PCR檢測Beta-TC-6細(xì)胞骨鈣素受體(Gprc6a)、GSIS相關(guān)葡萄糖轉(zhuǎn)運體(Glut2)、胰島素的變化趨勢,探討其能否改善胰島素分泌功能。

3. 用外源骨鈣素和高脂干預(yù)胰島Beta-TC-6細(xì)胞,Western blot檢測Gprc6a、Glut2以及PI3K/AKT/Fox O1/Pdx1信號通路的變化趨勢,GSIS試驗檢測β細(xì)胞胰島素的分泌量,q PCR檢測Gprc6a、Glut2、胰島素m RNA的改變,流式細(xì)胞術(shù)檢測β細(xì)胞的凋亡情況;進(jìn)一步使用PI3K抑制劑,觀察是否可阻斷骨鈣素的上述效應(yīng)。

4. 應(yīng)用慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染方法敲低胰島Beta-TC-6細(xì)胞Gprc6a基因,并使用Fox O1抑制劑、Pdx1激活劑分別干預(yù)PI3K/AKT/Fox O1/Pdx1通路的關(guān)鍵分子,探討骨鈣素促進(jìn)胰島素分泌的相關(guān)機制。

結(jié)果:1.誘導(dǎo)分化14天成骨細(xì)胞骨鈣素與Runx2蛋白合成分泌量達(dá)高峰(P<0.05),礦化結(jié)節(jié)較多,證明本實驗最適誘導(dǎo)時間為14天。

2. 與對照組相比,高糖高脂干預(yù)可明顯降低Runx2和骨鈣素水平(P<0.05),礦化結(jié)節(jié)減少,證明糖脂毒性可抑制成骨分化。

3. 過表達(dá)成骨細(xì)胞的Ins R基因可增加Runx2、骨鈣素的表達(dá)(P<0.05),促進(jìn)成骨細(xì)胞分化,改善高糖高脂導(dǎo)致的成骨細(xì)胞分化障礙(P<0.05)。

4.使用過表達(dá)Ins R的成骨細(xì)胞條件培養(yǎng)基干預(yù),可上調(diào)β細(xì)胞膜Glut2、Gprc6a的表達(dá),增加Beta-TC-6細(xì)胞胰島素m RNA水平,并改善脂毒性引起的Beta-TC-6細(xì)胞Glut2、胰島素的下調(diào),且上述作用可被骨鈣素中和抗體抑制(P<0.05)。

參考文獻(xiàn)

[1]The carboxylation status of osteocalcin has important consequences for its structure and dynamics[J].Kapoor Karan;Pi Min;Nishimoto Satoru Kenneth;Quarles Leigh Darryl;Baudry Jerome;Smith Jeremy C..Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-General Subjects,2020(prep)

[2]Highly Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Pancreatic Progenitors Co-expressing PDX1 and NKX6.1.[J].Memon Bushra;Abdelalim Essam M.Methods in molecular biology(Clifton,N.J.),2020

[3]Targeting Pyruvate Kinase PEPs Up Insulin Secretion and Improves Glucose Homeostasis[J].Corkey Barbara E..Cell Metabolism,2020(5)

[4]Pharmacology and physiological function of the orphan GPRC6A receptor.[J].J?rgensen Christinna V;;Br?uner-Osborne Hans.Basic&clinical pharmacology&toxicology,2020(s6)

[5]張亞芳.骨鈣素對脂毒性Beta-TC-6細(xì)胞胰島素分泌障礙的影響及其機制研究[D].福建醫(yī)科大學(xué),2021