背景^[1-3]

倉(cāng)鼠肺細(xì)胞源自一只雌性中國(guó)倉(cāng)鼠的肺組織，原名V細(xì)胞株，1958年Elkind將其改名為V79并用于研究培養(yǎng)中的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的X-放射線誘導(dǎo)的損傷及修復(fù)。該細(xì)胞免疫球蛋白產(chǎn)物和EB病毒表達(dá)為陰性。該細(xì)胞表達(dá)Fas抗原且對(duì)TNF和抗-Fas抗體敏感。

倉(cāng)鼠肺細(xì)胞

倉(cāng)鼠肺細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)步驟

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：

1）準(zhǔn)備DMEM培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%；雙抗1%。

2）培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3）凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。

二．倉(cāng)鼠肺細(xì)胞細(xì)胞處理：

1）凍存細(xì)胞的復(fù)蘇：

將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含4-6mL完全培養(yǎng)基的離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。然后將細(xì)胞懸液加入含6-8ml完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶（或皿）中37℃培養(yǎng)過(guò)夜。第二天顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況和細(xì)胞密度。

2）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

對(duì)于貼壁細(xì)胞傳代可以參考以下方法：

1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。

2.加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培養(yǎng)瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘（難消化的細(xì)胞可以適當(dāng)延長(zhǎng)消化時(shí)間），然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入3-4ml含10%FBS的培養(yǎng)基來(lái)終止消化。

3.輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。將細(xì)胞懸液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照說(shuō)明書(shū)要求配置的新的完全培養(yǎng)基以保持細(xì)胞的生長(zhǎng)活力，后續(xù)傳代根據(jù)實(shí)際情況按1:2~1:5的比例進(jìn)行。

3）細(xì)胞凍存:收到細(xì)胞后建議在培養(yǎng)前3代時(shí)凍存一批細(xì)胞種子以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

下面T25瓶為例；

1.細(xì)胞凍存時(shí)按照細(xì)胞傳代的過(guò)程收集消化好的細(xì)胞到離心管中，可使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，來(lái)決定細(xì)胞的凍存密度。一般細(xì)胞的推薦凍存密度為1×106~1×107個(gè)活細(xì)胞/ml.

2.1000rpm離心3-5min，去掉上清。用配制好的細(xì)胞凍存液重懸細(xì)胞，按每1ml凍存液含1×106~1×107個(gè)活細(xì)胞/ml分配到一個(gè)凍存管中將細(xì)胞分配到凍存管中，標(biāo)注好名稱(chēng)、代數(shù)、日期等信息。

3.將要凍存的細(xì)胞置于程序降溫盒中，-80度冰箱中過(guò)夜，之后轉(zhuǎn)入液氮容器中儲(chǔ)存。同時(shí)記錄好凍存管在液氮容器中的位置以便后續(xù)查閱和使用。

應(yīng)用^[4][5]

倉(cāng)鼠肺細(xì)胞可以用于DDT對(duì)中國(guó)倉(cāng)鼠肺成纖維細(xì)胞（V79）遺傳毒性的研究

研究DDT對(duì)中國(guó)倉(cāng)鼠肺成纖維細(xì)胞V79的遺傳毒性。

方法:MTT法測(cè)定細(xì)胞活性,集落形成試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖,微核實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞毒性,染色體畸變分析檢測(cè)細(xì)胞遺傳損傷。

結(jié)果:與溶劑對(duì)照組相比,MTT法結(jié)果顯示,分別處理4h、8h、12h、24h時(shí)6.25μg/ml、12.50μg/ml、25.00μg/ml、50.00μg/ml DDT均可降低V79細(xì)胞的活性,與10μg/ml CP的作用類(lèi)似,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),并表現(xiàn)出良好的劑量效應(yīng)關(guān)系和時(shí)間效應(yīng)關(guān)系。集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,處理4h、8h、12h、24h時(shí)12.50μg/ml、25.00μg/ml、50.00μg/ml DDT可抑制V79細(xì)胞的增殖,與10μg/ml CP的作用類(lèi)似具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),具有良好的劑量效應(yīng)和時(shí)間效應(yīng)關(guān)系。

微核實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在無(wú)體外活化系統(tǒng)S9參與時(shí),DDT各濃度組對(duì)V79細(xì)胞微核率結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),表明DDT對(duì)V79細(xì)胞無(wú)明顯DNA損傷,沒(méi)有表現(xiàn)出遺傳毒性;添加S9以后,6.25μg/ml、12.50μg/ml、25.00μg/ml、50.00μg/ml DDT均對(duì)V79細(xì)胞有顯著的遺傳毒性,此結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且在6.25μg/ml、50.00μg/ml劑量時(shí)呈現(xiàn)劑量效應(yīng)關(guān)系,該關(guān)系有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

染色體畸變?cè)囼?yàn)結(jié)果顯示,在不添加S9時(shí),DDT各濃度組對(duì)V79細(xì)胞染色體畸變效果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),視為對(duì)細(xì)胞染色體沒(méi)有造成損傷,無(wú)明顯致畸作用;在有S9系統(tǒng)參與以后,6.25μg/ml、12.50μg/ml、25.00μg/ml、50.00μg/ml DDT均對(duì)V79細(xì)胞染色體畸變有顯著影響,該影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),可造成細(xì)胞染色體損傷,且在6.25μg/ml、50.00μg/ml劑量時(shí)具有劑量效應(yīng)關(guān)系。

結(jié)論:DDT具有與環(huán)磷酰胺相似的細(xì)胞毒性,能夠降低V79細(xì)胞的細(xì)胞活性,抑制細(xì)胞增殖。在體外活化系統(tǒng)S9作用下,DDT可促使V79細(xì)胞微核率和染色體畸變發(fā)生率的增加,而無(wú)體外活化系統(tǒng)S9時(shí)此作用不明顯。其作用機(jī)制可能是在細(xì)胞有絲分裂的過(guò)程中,造成DNA和染色體的損傷,致使染色體發(fā)生突變、斷裂,從而表現(xiàn)出潛在的致畸作用。

參考文獻(xiàn)

[1]Organochlorine Pesticides,Polychlorinated Biphenyls,and Polybrominated Diphenyl Ethers in Irrawaddy Dolphins from India[J].K.Kannan;K.Ramu;N.Kajiwara;R.K.Sinha;S.Tanabe.Archives of Environmental Contamination and Toxicology,2005(3)

[2]Progress in study on endocrine disrupting pesticides(EDPs)in aquatic environment[J].Nandong Xue;;Hongbo Wang;;Xiaobai Xu.Chinese Science Bulletin,2005(20)

[3]Determination of polybrominated diphenyl ethers in marine biological tissues using microwave-assisted extraction[J].Stéphane Bayen;;Hian Kee Lee;;Jeffrey Philip Obbard.Journal of Chromatography A,2004(2)

[4]Sperm chromatin structure assay(scsa?)parameters are related to fertilization,blastocyst development,and ongoing pregnancy in in vitro fertilization and intracytoplasmic sperm injection cycles[J].Michael R Virro;;Kjersten L Larson-Cook;;Donald P Evenson.Fertility and Sterility,2004(5)

[5]喻琳.DDT對(duì)中國(guó)倉(cāng)鼠肺成纖維細(xì)胞（V79）遺傳毒性的研究[D].重慶醫(yī)科大學(xué),2010.