概述

堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase)在堿性環(huán)境中可催化水解磷酸酯。堿性磷酸酶的表達(dá)水平和活性變化與肝臟和骨骼的很多病理狀態(tài)有關(guān)。聯(lián)科生物的堿性磷酸酶活性檢測(cè)試劑盒以 4-硝基苯磷酸鹽(pNPP) 為底物，可方便、快捷、靈敏地檢測(cè)哺乳動(dòng)物的血清及其它生物樣品中的堿性磷酸酶活性。

組分

使用方法

1. 試劑準(zhǔn)備：取出所有試劑(包括檢測(cè)樣品)，恢復(fù)至室溫。 標(biāo)準(zhǔn)品工作液：取 15 μl p-nitrophenol 溶液(10 mM)，用檢測(cè)緩沖液稀釋至 0.3 ml，最終濃度為 0.5 mM。

2. 檢測(cè)方案參考如下。標(biāo)準(zhǔn)品的用量分別為 2、4、8、16、24、32 和 40 μl，推薦設(shè)兩個(gè)重復(fù)。樣品通常 加 50 μl，如樣品中的堿性磷酸酶活性過(guò)高，可減少樣品用量或適當(dāng)稀釋后。為消除有色樣本本身顏色 的影響，需設(shè)立樣品對(duì)照孔，即加入樣本，以檢測(cè)緩沖液代替顯色底物的對(duì)照。

3. 加完所有樣品后，在微孔板震蕩器上震蕩混勻數(shù)十秒。37℃避光孵育 5 - 10 分鐘。若待測(cè)樣品中堿性 磷酸酶活性較低，可適當(dāng)延長(zhǎng)孵育時(shí)間至 30 分鐘。

4. 每孔加入100 μl終止液終止反應(yīng)。

5. 在405 nm或400 - 415 nm范圍內(nèi)檢測(cè)吸光度。如不能立即測(cè)定，可在數(shù)小時(shí)內(nèi)完成測(cè)定，所顯現(xiàn)的黃色 在數(shù)小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。

6. 結(jié)果計(jì)算：將標(biāo)準(zhǔn)品孔的OD值減去空白對(duì)照孔的OD值，校準(zhǔn)后的標(biāo)準(zhǔn)品孔OD值與對(duì)應(yīng)的p-nitrophenol 濃度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品孔的OD值減去樣品對(duì)照孔的OD值，校準(zhǔn)后的樣品OD值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算 p-nitrophenol濃度。 堿性磷酸酶活性(U/ml) = A/V/T。其中A為樣品中產(chǎn)生的p-nitrophenol量(μmol)；V為樣品體積(ml)；T為 反應(yīng)時(shí)間(min)。

7. 堿性磷酸酶活性單位的定義：在 pH9.8 的 DEA 緩沖液中，37℃條件下，每分鐘水解 pNPP 顯色底物產(chǎn) 生 1 μmol p-nitrophenol 所需的堿性磷酸酶的量定義為一個(gè)酶活力單位，也被稱(chēng)作一個(gè) DEA酶活力單位。在 pH9.6 的甘氨酸緩沖液中，25℃條件下，每分鐘水解 pNPP 顯色底物產(chǎn)生 1 μmol p-nitrophenol 所需 的堿性磷酸酶的量定義為一個(gè)酶活力單位，也被稱(chēng)作一個(gè) Glycine 酶活力單位。一個(gè) Glycine 酶活力單 位約相當(dāng)于 3 個(gè) DEA 酶活力單位。本試劑盒測(cè)定的是 DEA 酶活力單位。

注意事項(xiàng)

1. 請(qǐng)?jiān)谑褂帽井a(chǎn)品前仔細(xì)閱讀說(shuō)明書(shū)。本產(chǎn)品僅用于科研，不可用于診斷。

2. 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿戴實(shí)驗(yàn)防護(hù)服、手套、口罩等必要的防護(hù)裝備。

3. 樣品中不能含有磷酸酶抑制劑，如EDTA、草酸鹽、氟化物和檸檬酸鹽等。

4. 所有樣品避免反復(fù)凍融，建議分裝后凍存。

5. 血清樣品通常需10倍稀釋?zhuān)渌鼧悠房勺鎏荻认♂專(zhuān)筄D值落于標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測(cè)范圍內(nèi)?？捎迷呀?液 或PBS或本試劑盒提供的檢測(cè)緩沖液進(jìn)行稀釋。

參考文獻(xiàn)

磷酸酶活性分析試劑盒產(chǎn)品介紹