背景[1-3]
人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞是一種典型的小細(xì)胞性肺癌細(xì)胞，表達(dá)較高水平的4種生化標(biāo)志：神經(jīng)特異性烯醇、肌酸激酶腦型同工酶、左旋多巴脫羧酶、鈴蟾肽樣免疫活性。c-mycDNA序列沒有擴(kuò)增；未發(fā)現(xiàn)大的結(jié)構(gòu)DNA的異常；該細(xì)胞合成與正常肺相當(dāng)量的p53mRNA。該細(xì)胞以聚集體的形式懸浮生長，只有聚集體中的細(xì)胞是有活力的，但是細(xì)胞活率無法估計(jì)，一般培養(yǎng)基中含有大量的細(xì)胞碎片。
人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞
人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞操作流程：
1、收到人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞后，請按照以下方法進(jìn)行操作：
取出25cm2培養(yǎng)瓶，75%酒精擦拭培養(yǎng)瓶，拆下封口膜，放入37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置3-4小時(shí)以穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)，然后換用新鮮完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)或進(jìn)行傳代。
2、人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞傳代：
1）人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞生長至覆蓋培養(yǎng)瓶的80%面積時(shí)，棄25cm2培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用PBS清洗細(xì)胞一次；
2）添加0.25%胰蛋白酶消化液約1ml至培養(yǎng)瓶中，倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞回縮變圓后加入完全培養(yǎng)液終止消化，再輕輕吹打細(xì)胞使之脫落，然后將懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，1000rpm離心5min；
3）棄上清，沉淀細(xì)胞用12ml完全培養(yǎng)基重懸，然后按1:2比例進(jìn)行分瓶傳代，然后放入37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
4）待人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞完全貼壁后，觀察培養(yǎng)結(jié)果，之后進(jìn)行換液培養(yǎng)或傳代。
3、人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凍存：
1）人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞生長至覆蓋培養(yǎng)瓶的80%面積時(shí)，棄25cm2培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用PBS清洗細(xì)胞一次；
2）添加0.25%胰蛋白酶消化液約1ml至培養(yǎng)瓶中，倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞回縮變圓后加入完全培養(yǎng)液終止消化，輕輕吹打細(xì)胞使之脫落，然后將懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，1000rpm離心5min；
3）用適量的凍存液（FBS：DMSO=9：1）重懸人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞，并放置于凍存管中；
4）先將人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凍存管放置于-20℃1.5h，然后將其移入-80℃過夜，24h后轉(zhuǎn)入液氮中進(jìn)行長期保存。使用程序降溫盒可直接放入-80℃。
4、人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞復(fù)蘇：
1）從液氮中取出人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凍存管（注意：佩戴防爆管面具），快速將其置入37℃水浴中解凍，直至凍存管中無結(jié)晶，然后用75%的酒精擦拭凍存管外壁；
2）將凍存管中的細(xì)胞移至含5ml完全培養(yǎng)基的15ml離心管中，1000rpm離心5min；
3）棄上清，沉淀用5ml完全培養(yǎng)基重懸，接種25cm2培養(yǎng)瓶，于37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
4）第二天，換用新鮮完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。
應(yīng)用[4][5]
人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞可以用于分泌型去整合素金屬蛋白酶ADAM12S促進(jìn)小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制研究
定量蛋白組學(xué)和生化方法發(fā)現(xiàn)ADAM12S促進(jìn)SCLC細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的新機(jī)制目的:在SCLC細(xì)胞株中對ADAM12S調(diào)控的蛋白進(jìn)行系統(tǒng)的鑒定,尋找ADAM12S影響SCLC細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵蛋白。
方法:qRT-PCR方法檢測不同SCLC細(xì)胞株中ADAM12S的mRNA水平,篩選出低表達(dá)和高表達(dá)的細(xì)胞株;
利用慢病毒載體pLVX-IRES-ZsGreenl構(gòu)建ADAM12S過表達(dá)質(zhì)粒,包裝慢病毒、侵染ADAM12S低表達(dá)的H1688細(xì)胞株,利用流式細(xì)胞分選儀篩選穩(wěn)定表達(dá)ADAM12S/ZsGreen和ZsGreen對照細(xì)胞株;CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)研究ADAM12S對H1688細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的影響:采用細(xì)胞培養(yǎng)穩(wěn)定同位素標(biāo)記氨基酸(Stable isotope labeling by amino acids in cell culture,SILAC)技術(shù)標(biāo)記對照組和ADAM12S過表達(dá)組細(xì)胞,用Orbitrap質(zhì)譜儀分析酶解的多肽組份,用蛋白質(zhì)分析軟件MaxQuant搜索數(shù)據(jù)庫鑒定蛋白質(zhì),根據(jù)SILAC標(biāo)記獲得各個(gè)蛋白質(zhì)在兩個(gè)樣品中的相對豐度,獲得SCLC細(xì)胞中ADAM12S過表達(dá)后顯著變化的蛋白;
利用DAVID數(shù)據(jù)庫分析ADAM12S調(diào)控的蛋白,分析ADAM12S所參與的生物學(xué)功能以及胞內(nèi)信號通路;
Western Blotting(WB)驗(yàn)證質(zhì)譜獲得的差異較大且與細(xì)胞增殖、遷移和侵襲相關(guān)的調(diào)控蛋白;qRT-PCR方法驗(yàn)證質(zhì)譜鑒定上調(diào)的Ⅰ型己糖激酶(Hexokinase I,HK1)的mRNA水平;WB方法檢測HK1轉(zhuǎn)錄因子c-Myc的蛋白水平以及上游通路Akt/ERK的蛋白和磷酸化水平;
在高表達(dá)ADAM12S的細(xì)胞株中用siRNA敲低ADAM12S觀察HK1的變化;siRNA敲低HK1后觀察ADAM12S對細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響;構(gòu)建敲低HK1的shRNA慢病毒質(zhì)粒,在穩(wěn)定過表達(dá)ADAM12S的H1688細(xì)胞株中敲低HK1,進(jìn)行克隆形成實(shí)驗(yàn);
同時(shí)在shRNA穩(wěn)定敲低HK1的細(xì)胞株中檢測細(xì)胞的乳酸代謝和葡萄糖攝取能力。
研究結(jié)果:通過三次生物學(xué)重復(fù)和定量分析共鑒定到了70個(gè)ADAM12S調(diào)控的蛋白,并對這些調(diào)控蛋白進(jìn)行生物學(xué)功能分析,發(fā)現(xiàn)其中許多蛋白參與三羧酸循環(huán)、糖異生、糖酵解等代謝途徑。
生物化學(xué)方法驗(yàn)證了微囊蛋白1(Caveolin-1,CAV1)、半胱氨酸甘氨酸豐富蛋白1(Cysteine and glycine-rich protein 1,CSRP1)、膜聯(lián)蛋白A6(Annexin A6,ANXA6)、谷氨酸草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶1(Aspartate aminotransferase,GOT1)、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(Glucose-6-phosphate 1-dehydrogenase,G6PD)以及HK1等蛋白與ADAM12S的調(diào)控關(guān)系,與質(zhì)譜結(jié)果一致,均被ADAM12S上調(diào)。在多種與代謝相關(guān)的蛋白中,發(fā)現(xiàn)糖酵解途徑關(guān)鍵限速酶HK1與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在H1688細(xì)胞株中過表達(dá)ADAM12S后,HK1 amRNA水平和蛋白水平均顯著上調(diào),而HK2沒有上調(diào)趨勢;在H446細(xì)胞中敲低ADAM12S,HK1蛋白水平下調(diào);
乳酸代謝和葡萄糖攝取實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,過表達(dá)ADAM12S,乳酸代謝和葡萄糖攝取均上調(diào),但敲低HK1后,上調(diào)作用被明顯抑制。增殖、遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)表明,當(dāng)敲低HK1后,ADM12S引起的增殖、遷移和侵襲均下降,而且ADAM12S對克隆形成的促進(jìn)作用也被顯著抑制。
參考文獻(xiàn)
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