背景^[1-3]

人結(jié)腸癌細(xì)胞源自原位直腸腺癌，人結(jié)腸癌細(xì)胞和SW620細(xì)胞源自同一病人一年后的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。CSAp和直腸抗體3陰性；角蛋白免疫過氧化物酶染色陽性。p53基因第273位密碼子的G→A突變引起Arg→His替代，309位密碼子的C→T突變導(dǎo)致Pro→Ser替代。人結(jié)腸癌細(xì)胞p53蛋白表達(dá)水平提高，癌基因c-myc、K-ras、H-ras、N-ras、myb、sis和fos的表達(dá)呈陽性，癌基因N-myc的表達(dá)未做檢測。人結(jié)腸癌細(xì)胞不表達(dá)細(xì)胞溶解酶，一種與腫瘤入侵相關(guān)的金屬蛋白酶。有報道稱，人結(jié)腸癌細(xì)胞表達(dá)GM-CSF。人結(jié)腸癌細(xì)胞ras原癌基因的12位密碼子有一個突變，可以用作PCR法檢測該突變的陽性對照。

人結(jié)腸癌細(xì)胞

人結(jié)腸癌細(xì)胞接受后處理

1)收到人結(jié)腸癌細(xì)胞后，請檢查是否漏液。

2)請先在顯微鏡下確認(rèn)人結(jié)腸癌細(xì)胞生長狀態(tài)，去掉封口膜并將T25瓶置于37℃培養(yǎng)約2-3h。

3)棄去T25瓶中的培養(yǎng)基，添加6ml完全培養(yǎng)基。

4)如果人結(jié)腸癌細(xì)胞密度達(dá)80%-90%請及時進(jìn)行細(xì)胞傳代，傳代培養(yǎng)用6ml人結(jié)腸癌細(xì)胞完全培養(yǎng)基。

5)接到細(xì)胞次日，請檢查細(xì)胞是否污染。

人結(jié)腸癌細(xì)胞培養(yǎng)操作

1）復(fù)蘇人結(jié)腸癌細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10cm皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2）人結(jié)腸癌細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。

2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

3.按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。

4.將細(xì)胞懸液按1：2比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

3）人結(jié)腸癌細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。下面T25瓶為類；

1.人結(jié)腸癌細(xì)胞凍存時，棄去培養(yǎng)基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，細(xì)胞變圓脫落后，加入1ml含血清的培養(yǎng)基終止消化，可使用血球計數(shù)板計數(shù)。

2.4 min 1000rpm離心去掉上清。加1ml血清重懸細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入血清和DMSO，輕輕混勻，DMSO終濃度為10%，細(xì)胞密度不低于1x106/ml，每支凍存管凍存1ml細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識。

3.將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80度冰箱，2個小時以后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

應(yīng)用^[4][5]

人結(jié)腸癌細(xì)胞可以用于放線菌素V誘導(dǎo)人結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的機(jī)理研究

對比放線菌素D與放線菌素V在人結(jié)腸癌細(xì)胞中的體外抑增殖作用,發(fā)現(xiàn)其作用比放線菌素D更強(qiáng)。從而我們以放線菌素V為研究對象,使用人結(jié)腸癌細(xì)胞去探究其作用及機(jī)制,希望為放線菌素V的結(jié)腸癌臨床治療方面提供更多前期研究資料,主要研究結(jié)果如下:

1. 放線菌素V在體外抑制結(jié)腸癌細(xì)胞生長通過MTT法,使用放線菌素V和放線菌素D分別處理結(jié)腸癌細(xì)胞24、48及72h,隨著濃度和作用時間的增加,存活的細(xì)胞減少,呈明顯的濃度及時間依賴性。測得放線菌素V對結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116細(xì)胞的半數(shù)致死濃度(IC50)為2.85±0.10 nmol/L,對SW620的IC50為6.43±0.16 nmol/L,并且其對人正常肝腎細(xì)胞的毒性小于放線菌素D,可以繼續(xù)研究其作為放線菌素D替代品的潛在可能性。

2. 放線菌素V誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞發(fā)生凋亡放線菌素V可以抑制結(jié)腸癌細(xì)胞生長,且對細(xì)胞的抑制作用體現(xiàn)在其可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。通過流式細(xì)胞術(shù)對處理組細(xì)胞進(jìn)行檢測分析,可以得出:加藥后,細(xì)胞出現(xiàn)凋亡,且隨著加藥濃度的增加,出現(xiàn)凋亡的細(xì)胞越多,且大多集中在早期凋亡階段。DAPI染色后用熒光顯微鏡觀察,發(fā)現(xiàn)用藥細(xì)胞中細(xì)胞核皺縮,出現(xiàn)凋亡小體,進(jìn)一步使用蛋白質(zhì)免疫印跡法確定在用藥細(xì)胞中凋亡蛋白Bax/Bcl-2的比值上升,在微觀蛋白層面上證明用藥細(xì)胞發(fā)生凋亡。

3. 放線菌素V通過線粒體途徑及PI3K/Akt途徑誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡放線菌素V在結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞中引起線粒體膜電勢降低,JC-1染色及流式細(xì)胞分析可以確定用藥細(xì)胞線粒體膜電勢發(fā)生明顯降低,提示出現(xiàn)線粒體損傷。蛋白免疫印跡法檢測用藥細(xì)胞線粒體中的細(xì)胞色素C增加,且誘導(dǎo)caspase蛋白的級聯(lián)反應(yīng),cleaved caspase-9增加,最后導(dǎo)致凋亡效應(yīng)蛋白cleaved caspase-3增加并執(zhí)行凋亡。

另外,放線菌素V也抑制PI3K-AKT蛋白通路相關(guān)蛋白的表達(dá),使用免疫熒光染色確定P-Akt在細(xì)胞中的分布減少,蛋白質(zhì)免疫印跡法進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)PI3K,P-Akt/Akt蛋白表達(dá)量減少。我們還采用了分子對接模型及HTRF等測試驗(yàn)證了放線菌素V對PI3K蛋白的親和性。結(jié)果表明,放線菌素V誘導(dǎo)人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116細(xì)胞凋亡與線粒體凋亡及PI3K-AKT通路密切相關(guān),且其與PI3K蛋白有靶向結(jié)合傾向。

參考文獻(xiàn)

[1]Discovery of actinomycin L,a new member of the actinomycin family of antibiotics[J].Machushynets Nataliia V.;Elsayed Somayah S.;Du Chao;Siegler Maxime A.;de la Cruz Mercedes;Genilloud Olga;Hankemeier Thomas;van Wezel Gilles P..Scientific Reports,2022(1)

[2]Apoptosis regulation at the mitochondria membrane level.[J].Dadsena Shashank;King Louise E;GarcíaSáez Ana J.Biochimica et biophysica acta.Biomembranes,2021(12)

[3]Molecular mechanisms of cell death in neurological diseases.[J].Moujalled Diane;Strasser Andreas;Liddell Jeffrey R.Cell death and differentiation,2021(7)

[4]Mechanisms of mitochondrial cell death[J].Dadsena Shashank;Zollo Cristiana;García-Sáez Ana J..Biochemical Society Transactions,2021(2)

[5]蔣詩清.放線菌素V誘導(dǎo)人結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的機(jī)理研究[D].山東大學(xué),2022.