背景^[1-3]

人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞是由BiedlerJL建立的兩株神經(jīng)組織來源的細(xì)胞中的一株（另一株是SK-N-MC）。與SK-N-MC不同，該細(xì)胞倍增時(shí)間更長，表達(dá)更高水平的多巴胺-β-羥化酶；常作為細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性分析的靶細(xì)胞。

人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞

人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞培養(yǎng)步驟：

一．人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：

1）準(zhǔn)備MEM培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%；+1%NEAA+1%Gluta-max+1%丙酮酸鈉+1%P/S雙抗

2）人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3）人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。

二．人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞處理：

1）復(fù)蘇人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞：將含有1mL人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⑷松窠?jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞懸液加入250px皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞密度。

2）人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞傳代：如果人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

對(duì)于貼壁人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞，傳代可參考以下方法：

1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

3.按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。

4.將人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

3）人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。

下面T25瓶為類；

1，人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞凍存時(shí)，棄去培養(yǎng)基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞變圓脫落后，加入1ml含血清的培養(yǎng)基終止消化，可使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。

2，4min 1000rpm離心去掉上清。加1ml血清重懸細(xì)胞，根據(jù)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞數(shù)量加入血清和DMSO，輕輕混勻，DMSO終濃度為10%，細(xì)胞密度不低于1x106/ml，每支凍存管凍存1ml人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識(shí)。

3，將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80度冰箱，至少2個(gè)小時(shí)以后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

應(yīng)用^[4][5]

人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞可以用于鹽酸去氫駱駝蓬堿對(duì)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的抑制作用及其機(jī)制初探

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接技術(shù),初步探討鹽酸去氫駱駝蓬堿(Harmine Hydrochloride,HMH)抑制人神經(jīng)母細(xì)胞瘤(Nueroblastoma,NB)的可能作用靶點(diǎn),并運(yùn)用細(xì)胞及分子生物學(xué)手段驗(yàn)證HMH對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的抑制作用及其作用機(jī)制。

方法:(1)采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測HMH作用于NB的可能作用靶點(diǎn),再利用DAVID數(shù)據(jù)庫對(duì)潛在靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體(Gene Ontology,GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析;

(2) 利用分子對(duì)接技術(shù)對(duì)HMH與可能的核心靶點(diǎn)進(jìn)行對(duì)接分析;

(3) 通過MTT法及克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測不同濃度HMH對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響;

(4) 采用Hoechst/PI染色法觀察不同濃度HMH對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞形態(tài)變化的影響;

(5) 利用Western blot法檢測不同濃度HMH對(duì)凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-3、Caspase-3及自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ、P62表達(dá)的影響;

(6) 采用Western blot法檢測同時(shí)給予HMH和自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)時(shí)對(duì)LC3-Ⅱ、P62蛋白表達(dá)的影響及細(xì)胞形態(tài)的改變;

(7) 利用Western blot法檢測HMH對(duì)Akt、m TOR蛋白磷酸化水平的影響;

(8) 利用DCFH-DA探針檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧簇(Reactive oxygen species,ROS)的水平;

結(jié)果:網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:

(1) 共獲得HMH治療NB的36個(gè)潛在靶點(diǎn),GO富集分析獲得155個(gè)相關(guān)過程,KEGG通路分析獲得63條信號(hào)通路;

(2) 通過拓?fù)浞治龉搏@得CASP3、MAPK1、MMP2等14個(gè)核心靶點(diǎn),HMH與各核心靶蛋白均能較好的結(jié)合。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,給予HMH干預(yù)24 h后,隨著HMH濃度的增加:(1)SH-SY5Y細(xì)胞存活率下降,克隆的數(shù)量和大小明顯減少(P<0.05);(2)SH-SY5Y細(xì)胞形態(tài)發(fā)生顯著的凋亡樣變化(P<0.05);

(3) 同時(shí),凋亡相關(guān)蛋白Bax/Bcl-2、Cleaved caspase-3/Caspase-3的比值顯著增加,與自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ的表達(dá)量明顯增加,而P62的表達(dá)量顯著減少(P<0.05);

(4) HMH濃度為40μmol·L-1時(shí),HMH與3-MA聯(lián)合應(yīng)用組,與單獨(dú)HMH處理組相比LC3-Ⅱ的表達(dá)量降低(P<0.05),細(xì)胞存活率明顯降低;

(5) HMH濃度為40μmol·L-1時(shí),與對(duì)照組相比,Akt、m TOR蛋白的磷酸化水平降低(P<0.05);

(6)給藥24 h后,隨著HMH濃度的增加,細(xì)胞內(nèi)ROS水平也顯著升高(P<0.05)。

參考文獻(xiàn)

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