背景^[1-3]

BHT101由一名罹患甲狀腺未分化癌的63歲女性的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中建立；據(jù)報(bào)道，該細(xì)胞不產(chǎn)生激素，但甲狀腺球蛋白和甲狀腺素部分呈陽(yáng)性。經(jīng)本庫(kù)STR檢測(cè)結(jié)果無(wú)誤。STR結(jié)果如下：D5S818:10,11；D13S317:12；D7S820:10,11；D16S539:9，11；vWA:19；THO1:9,9.3；Amelogenin:X；TPOX:8；CSF1PO:12,13。

BHT101

BHT101細(xì)胞培養(yǎng)操作

1）復(fù)蘇BHT101細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10cm皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過(guò)夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2）BHT101細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。

2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

3.按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。

4.將細(xì)胞懸液按1：2比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

3）BHT101細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。下面T25瓶為類；

1.BHT101細(xì)胞凍存時(shí)，棄去培養(yǎng)基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，細(xì)胞變圓脫落后，加入1ml含血清的培養(yǎng)基終止消化，可使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。

2.4 min 1000rpm離心去掉上清。加1ml血清重懸細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入血清和DMSO，輕輕混勻，DMSO終濃度為10%，細(xì)胞密度不低于1x106/ml，每支凍存管凍存1ml細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識(shí)。

3.將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80度冰箱，2個(gè)小時(shí)以后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

應(yīng)用^[4][5]

BHT101可以用于青蒿琥酯調(diào)控E2F1抑制甲狀腺癌增殖和侵襲的機(jī)制研究

通過(guò)研究青蒿琥酯對(duì)甲狀腺癌細(xì)胞的影響,建立裸鼠移植瘤模型,在體外和體內(nèi)探討青蒿琥酯對(duì)甲狀腺癌的抗癌作用,并探究其作用機(jī)制,擬為甲狀腺癌患者預(yù)測(cè)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后評(píng)估提供新的可靠依據(jù),并為腫瘤轉(zhuǎn)移調(diào)控模式提供新的思路和完善依據(jù),為開(kāi)發(fā)新型治療策略提供理論依據(jù)。

方法:1.體外實(shí)驗(yàn)(1)青蒿琥酯對(duì)甲狀腺癌細(xì)胞增殖的影響。用20μM、40μM、80μM的青蒿琥酯處理甲狀腺癌BHT101和TPC1細(xì)胞24h,同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照組。通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ART對(duì)BHT101和TPC1細(xì)胞增殖活力的影響。通過(guò)Ed U(5-Ethynyl-2’-deoxyuridine)實(shí)驗(yàn)和克隆形成實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測(cè)ART對(duì)BHT101和TPC1細(xì)胞增殖的影響。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ART對(duì)BHT101和TPC1細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響。通過(guò)Western-blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ART對(duì)BHT101和TPC1細(xì)胞遷移相關(guān)蛋白E-鈣粘蛋白、N-鈣粘蛋白和波形蛋白表達(dá)的影響。通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ART對(duì)BHT101和TPC1細(xì)胞遷移能力的影響。通過(guò)Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ART對(duì)BHT101和TPC1細(xì)胞侵襲能力的影響。

(2) 青蒿琥酯對(duì)甲狀腺癌細(xì)胞作用機(jī)制的研究。對(duì)青蒿琥酯處理的細(xì)胞及對(duì)照組細(xì)胞進(jìn)行m RNA轉(zhuǎn)錄組二代測(cè)序,每組做三個(gè)平行。通過(guò)生物信息學(xué)對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行分析,篩選差異基因并富集基因,進(jìn)行通路富集分析,同時(shí)進(jìn)行GSEA分析。通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析進(jìn)行分子對(duì)接尋找ART作用靶蛋白。

2. 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)(1)4周齡的雌性BABL/c裸鼠,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,將TPC1細(xì)胞(2×107)皮下注射到裸鼠中,建立甲狀腺癌異種移植裸鼠。將小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和給藥組,給藥組小鼠進(jìn)行灌胃給藥,對(duì)照組小鼠給予生理鹽水灌胃,一周后觀察成瘤情況。每?jī)商毂O(jiān)測(cè)一次小鼠的腫瘤生長(zhǎng),5周后斷頸處死裸鼠,在小鼠死亡后解剖取材,稱重并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3. 腫瘤組織行免疫組化Ki-67染色和Tunel染色,確定腫瘤細(xì)胞增殖指數(shù)和凋亡率。提取腫瘤組織的蛋白,利用Western-blot檢測(cè)腫瘤組織中凋亡相關(guān)蛋白bax、bcl-2、RAPR的蛋白表達(dá)水平。同時(shí)通過(guò)Western-blot檢測(cè)腫瘤組織中E2F1相關(guān)蛋白E2F1、c-Myc、Cyclin E的表達(dá)水平。

結(jié)果:1.體外實(shí)驗(yàn)(1)加入青蒿琥酯后,BHT101和TPC1細(xì)胞的OD值均降低,且青蒿琥酯劑量依賴性降低BHT101和TPC1細(xì)胞的OD值,青蒿琥酯劑量依賴性降低BHT101和TPC1細(xì)胞的細(xì)胞活力。加入青蒿琥酯后,BHT101和TPC1細(xì)胞克隆集落數(shù)均減少,其中,低濃度(20μM)青蒿琥酯明顯減少克隆集落數(shù)(P<0.05),中濃度(40μM)和高濃度(80μM)對(duì)克隆集落數(shù)形成的抑制能力更強(qiáng)(P<0.001),表明青蒿琥酯具有降低BHT101和TPC1細(xì)胞的增殖的能力。Ed U實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示青蒿琥酯作用后Ki-67陽(yáng)性數(shù)量減少,隨著青蒿琥酯濃度的增加,Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量呈遞減趨勢(shì)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,青蒿琥酯抑制BHT101和TPC1細(xì)胞的增殖能力,且呈劑量依賴性。

劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,青蒿琥酯孵育BHT101和TPC1細(xì)胞24小時(shí)后,與對(duì)照組相比,劃痕面積增加,且隨著青蒿琥酯濃度增加劃痕面積逐漸增加,表明青蒿琥酯降低BHT101和TPC1細(xì)胞的遷移能力。Transwell結(jié)果顯示,青蒿琥酯孵育BHT101和TPC1細(xì)胞24小時(shí)后,與對(duì)照組相比,通過(guò)Transwell小室的細(xì)胞數(shù)量減少,呈劑量依賴性。結(jié)果顯示ART降低BHT101和TPC1細(xì)胞的侵襲能力。此外,進(jìn)一步通過(guò)Western-blot檢測(cè)遷移相關(guān)蛋白的表達(dá),從蛋白水平檢測(cè)青蒿琥酯對(duì)甲狀腺癌細(xì)胞遷移的影響。

結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,隨著青蒿琥酯濃度的增加,BHT101和TPC1細(xì)胞中E-鈣粘蛋白表達(dá)增加,同時(shí),波形蛋白和N-鈣粘蛋白表達(dá)下降。進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析顯示青蒿琥酯劑量依賴性地增加E-鈣粘蛋白表達(dá),抑制波形蛋白和N-鈣粘蛋白表達(dá)(P<0.05)。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析可以看出,與對(duì)照組相比,加入青蒿琥酯后,BHT101和TPC1細(xì)胞凋亡的比率增加(P<0.01),呈劑量依賴性。

參考文獻(xiàn)

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