背景^[1-3]

大鼠腦動脈平滑肌細(xì)胞分離自腦動脈組織；腦動脈有成對的頸內(nèi)動脈和椎動脈互相銜接成動脈循環(huán)；靜脈系多不與同名動脈拌行，所收集的靜脈血先進(jìn)入靜脈竇再匯入頸內(nèi)靜脈；各級靜脈都沒有瓣膜。它包括腦的動脈系統(tǒng)和腦的靜脈系統(tǒng)。

大鼠腦動脈平滑肌細(xì)胞原代分離培養(yǎng)3天后，可見細(xì)胞貼壁伸展，細(xì)胞形態(tài)大小不一，呈梭形、不規(guī)則形、三角形或扇形，核卵圓形、居中；2周后細(xì)胞匯合，多數(shù)細(xì)胞伸展呈長梭形，胞漿豐富，有分枝狀突起，細(xì)胞平行排列成單層或部分區(qū)域多層重疊生長，高低起伏；細(xì)胞密度低時，常交織成網(wǎng)狀；密度高時，則排列為旋渦狀或柵欄狀。傳代后細(xì)胞生長較快，4-6天即可匯合，并保持上述形態(tài)學(xué)特征和生長特點(diǎn)。

大鼠腦動脈平滑肌細(xì)胞

大鼠腦動脈平滑肌細(xì)胞使用方法

大鼠腦動脈血管平滑肌細(xì)胞是一種貼壁細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)呈成纖維細(xì)胞樣，在澳睿賽技術(shù)部標(biāo)準(zhǔn)操作流程下，可傳5代左右；3代以內(nèi)狀態(tài)；建議您收到細(xì)胞后盡快進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

客戶收到細(xì)胞后，請按照以下方法進(jìn)行操作。

1.取出T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶，用75%酒精消毒瓶身，拆下封口膜，放入37℃、5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置3-4h，以穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)。

2.貼壁細(xì)胞消化

1)吸出T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，用PBS清洗細(xì)胞一次；

2)添加0.25%胰蛋白酶消化液1mL至T25培養(yǎng)瓶中，輕微轉(zhuǎn)動培養(yǎng)瓶至消化液覆蓋整個培養(yǎng)瓶底后，吸出多余胰蛋白酶消化液，37℃溫浴1-3min；倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞回縮變圓后，再加入5ml完全培養(yǎng)基終止消化；

3)用吸管輕輕吹打混勻，按傳代比例接種T25培養(yǎng)瓶傳代，然后補(bǔ)充新鮮的完全培養(yǎng)基至5mL，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)；

4)待細(xì)胞完全貼壁后，培養(yǎng)觀察；之后按照換液頻率更換新鮮的完全培養(yǎng)基。

3.大鼠腦動脈平滑肌細(xì)胞收貨脫落

1)收集所有細(xì)胞懸液，1000rpm，離心5min，保留沉淀；

2)添加0.25%胰蛋白酶消化液0.5mL至離心管中，重懸沉淀，放置于37℃消化3min(或4℃冰箱靜置5-7min)；消化完向離心管內(nèi)加入5ml完全培養(yǎng)基終止消化；

3)經(jīng)1000rpm，離心5min，丟棄上清，用5ml完全培養(yǎng)基(補(bǔ)加1%FBS，促進(jìn)貼壁)重懸沉淀，接種于新的培養(yǎng)瓶內(nèi)；

4)待細(xì)胞完全貼壁后，培養(yǎng)觀察；之后按照換液頻率更換新鮮的完全培養(yǎng)基(37℃預(yù)熱)。

4.大鼠腦動脈平滑肌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

因原代細(xì)胞貼壁特殊性，貼壁的原代細(xì)胞在消化后轉(zhuǎn)移至其他實(shí)驗(yàn)器皿（如玻璃爬片、培養(yǎng)板、共聚焦培養(yǎng)皿等）時，需要對實(shí)驗(yàn)器皿進(jìn)行包被，以增強(qiáng)細(xì)胞貼壁性，避免細(xì)胞因沒貼好影響實(shí)驗(yàn)；包被條件常選用鼠尾膠原Ⅰ（2-5μg/cm2），多聚賴氨酸PLL（0.1mg/ml），明膠（0.1%），依據(jù)細(xì)胞種類而定。懸浮/半懸浮細(xì)胞無需包被。

應(yīng)用^[4-5]

大鼠腦動脈平滑肌細(xì)胞可以用于異甘草素對自發(fā)性高血壓大鼠腦基底動脈平滑肌細(xì)胞大電導(dǎo)鈣激活鉀通道的作用

研究異甘草素(Isoliquiritigenin,ISL)對自發(fā)性高血壓大鼠(Spontaneously hypertension rats,SHR)腦基底動脈血管平滑肌細(xì)胞(Vascular smooth muscle cell,VSMC)大電導(dǎo)鈣激活鉀通道(Large conductance Ca-activated K 2++channel,BKCa)的調(diào)節(jié)作用。

方法:在使用異甘草素干預(yù)處理前后,用尾動脈測壓儀觀察SHR血壓變化;依次用10-5mol/L苯腎上腺素(phenylephrine,PE)、10-5 mol/L苯腎上腺素和10-4 mol/L異甘草素、10-5mol/L苯腎上腺素分別對SHR腦基底動脈灌流后,腦基底動脈的直徑應(yīng)用壓力型小動脈儀進(jìn)行測量;用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)研究SHR腦基底動脈平滑肌細(xì)胞(VSMC)BKCa通道電流的變化;用ELISA技術(shù)觀察SHR腦基底動脈內(nèi)c GMP水平變化。

結(jié)果:(1)ISL干預(yù)前SHR血壓是(218.3±1.6)mm Hg,與WKY血壓(119±2.1)mm Hg相比,兩者具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.01,n=6)。與ISL干預(yù)前相比,ISL灌胃(12mg/kg.d)14天后SHR血壓降至(119.2±1.9)mm Hg(p<0.01,n=6),但與WKY血壓沒有明顯差異;

(2) 含有PE(10-5 mol/L)的PSS液體在壓力型小動脈測量儀水浴槽內(nèi)持續(xù)對血管段進(jìn)行灌流,待血管段收縮狀態(tài)穩(wěn)定后,再用含有ISL(10-4 mol/L)和PE(10-5 mol/L)的PSS液體持續(xù)灌流沖洗,血管舒張達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)后,給予含PE(10-5 mol/L)的PSS液體再次持續(xù)灌流沖洗,記錄血管直徑分別為:(235.6±26)μm、(309.2±25)μm和(241.1±27)μm,提示ISL舒張SHR腦基底動脈(n=6,p<0.01);

(3) 單個腦基底動脈平滑肌細(xì)胞鉗制電壓在-40 m V,外向電流在刺激電壓-40-20 m V區(qū)間內(nèi)無顯著變化,10-4 mol/L ISL在0-60 m V區(qū)間內(nèi)可以呈電壓依賴性增強(qiáng)腦基底動脈平滑肌細(xì)胞外向電流(n=6,p<0.05);

(4) 在0、10-7、10-6、10-5、10-4和3×10-4 mol/L異甘草素作用下,平滑肌細(xì)胞+60m V時的外向電流分別是(144±25)p A、(156±24)p A、(173±24)p A、(211±21)p A、(252±21)p A和(262±20)p A。除10-7 mol/L異甘草素組和對照組沒有明顯差異外,其余各組均呈濃度依賴性增強(qiáng)外向電流,提示ISL呈濃度依賴性增強(qiáng)腦基底動脈平滑肌細(xì)胞外向電流(n=6,p<0.05),且增強(qiáng)平滑肌細(xì)胞外向電流的EC50為9.5μmol/L;

(5)異甘草素干預(yù)后的SHR平滑肌細(xì)胞外向電流(+60m V)從(212.1±32)p A增加到(283.2±28)p A(p<0.01,n=6),用10-3 mol/L四乙胺(TEA,BKCa通道阻斷劑)灌流3min后,SHR平滑肌細(xì)胞在+60m V時的外向電流減小到(143.4±21)p A(p<0.05,n=6)。

該結(jié)果提示異甘草素增強(qiáng)的平滑肌細(xì)胞外向電流由BKCa通道介導(dǎo);(6)預(yù)灌流10-5 mol/L亞甲藍(lán)(MB,可溶性鳥苷酸環(huán)化酶阻斷劑)3min后,異甘草素增強(qiáng)的平滑肌細(xì)胞外向電流(+60m V)從(324.3±74)p A減小到(171.9±42)p A(p<0.05,n=6),與對照組(163.9±43)p A相比沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

參考文獻(xiàn)

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