背景[1-3]
大鼠胚胎心肌細胞是一株由Kimes·B和Brandt·B從BD1X大鼠胚胎心臟組織的克隆細胞株亞克隆得到的細胞株；H9c2(2-1)細胞表現出許多骨骼肌的特性。H9c2(2-1)細胞中的成肌細胞能融合形成多核的肌管，并對乙酰膽堿的刺激發(fā)生反應。如果培養(yǎng)基中的血清濃度下降到1%，H9c2(2-1)細胞融合發(fā)生得很快。
大鼠胚胎心肌細胞
一．大鼠胚胎心肌細胞培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準備
1）準備DMEM培養(yǎng)基；優(yōu)質胎牛血清，10%；雙抗，1%。
2）大鼠胚胎心肌細胞培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。
3）大鼠胚胎心肌細胞凍存液：90%血清，10%DMSO，現用現配。
二．大鼠胚胎心肌細胞處理：
1）凍存細胞的復蘇：
將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含4-6mL完全培養(yǎng)基的離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，完全培養(yǎng)基重懸細胞。然后將細胞懸液加入含6-8ml完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶（或皿）中37℃培養(yǎng)過夜。第二天顯微鏡下觀察細胞生長情況和細胞密度。
2）大鼠胚胎心肌細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。
對于貼壁細胞傳代可以參考以下方法：
1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。
2.加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培養(yǎng)瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘（難消化的細胞可以適當延長消化時間），然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入3-4ml含10%FBS的培養(yǎng)基來終止消化。
3.輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。將細胞懸液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照說明書要求配置的新的完全培養(yǎng)基以保持細胞的生長活力，后續(xù)傳代根據實際情況按1:2~1:5的比例進行。
3）大鼠胚胎心肌細胞凍存:收到細胞后建議在培養(yǎng)前3代時凍存一批細胞種子以備后續(xù)實驗使用。
下面T25瓶為例；
1.細胞凍存時按照細胞傳代的過程收集消化好的細胞到離心管中，可使用血球計數板計數，來決定細胞的凍存密度。一般細胞的推薦凍存密度為1×106~1×107個活細胞/ml.
2.1000rpm離心3-5min，去掉上清。用配制好的細胞凍存液重懸細胞，按每1ml凍存液含1×106~1×107個活細胞/ml分配到一個凍存管中將細胞分配到凍存管中，標注好名稱、代數、日期等信息。
3.將要凍存的細胞置于程序降溫盒中，-80度冰箱中過夜，之后轉入液氮容器中儲存。同時記錄好凍存管在液氮容器中的位置以便后續(xù)查閱和使用。
應用[4][5]
大鼠胚胎心肌細胞可以用于miRNA-193a-3p對大鼠胚胎心肌細胞H9C2增殖和凋亡功能的影響
胚胎心臟發(fā)育和先心病的發(fā)生受多種遺傳因素共同調節(jié),TBX1(T-box factor1)基因、轉化生長因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)信號通路都已被證實是其中較為重要的環(huán)節(jié)。
前期研究發(fā)現,TBX1基因表達下調對TGF-β2及其通路的靶向調控可能是通過下調miR-193a-3p的表達實現的,但這條通路如何實現細胞水平的調控、對細胞功能有何影響目前仍不明確。鑒于許多miRNA對相關生物學活動的調控都依賴于對細胞的增殖或凋亡的調節(jié),本研究將從miR-193a-3p對大鼠胚胎心肌細胞H9C2增殖和凋亡的影響入手,推斷其參與心臟發(fā)育和先天性心臟病發(fā)病的可能作用機制。
方法(1)將miR-193a-3p mimics,miR-193a-3p inhibitor分別轉染至大鼠胚胎心肌細胞H9C2,qRT-PCR檢測轉染效率。
(2) 以CCK-8法分別檢測miR-193a-3p過表達和表達減低后細胞增殖能力的變化。
(3) 流式細胞術(Annexin V-FITC/PI雙染法)檢測轉染48h后心肌細胞的凋亡水平。
(4) 實驗數據使用SPSS19.0軟件分析(計量數據以均值±標準差表示,P<0.05為差異有統計學意義)。
結果(1)與NC組相比,miR-193a-3p過表達后H9C2細胞的增殖受到抑制(P<0.01),而miR-193a-3p表達減低后心肌細胞的增殖活性增加(P<0.05)。
(2) 與NC組相比,轉染miR-193a-3p mimics 48h后H9C2細胞的凋亡率增高(P<0.05),而轉染miR-193a-3p inhibitor 48h后心肌細胞的凋亡率減低(P<0.05),上述二者的改變均以早期凋亡為主。
結論miR-193a-3p能夠負向調節(jié)大鼠胚胎心肌細胞H9C2的增殖,正向調控其凋亡,其中對凋亡的調控環(huán)節(jié)可能位于凋亡早期;miR-193a-3p可能通過抑制心肌細胞的增殖、促進其凋亡參與心臟發(fā)育和先天性心臟病的發(fā)生。
參考文獻
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[4]Genetic Basis for Congenital Heart Disease:Revisited:A Scientific Statement From the American Heart Association.Mary Ella Pierpont;;Martina Brueckner;;Wendy K.Chung;;Vidu Garg;;Ronald V.Lacro;;Amy L.McGuire;;Seema Mital;;James R.Priest;;William T.Pu;;Amy Roberts;;Stephanie M.Ware;;Bruce D.Gelb;;Mark W.Russell.Circulation,2018
[5]趙雪琦.miRNA-193a-3p對大鼠胚胎心肌細胞H9C2增殖和凋亡功能的影響[D].中國醫(yī)科大學,2021.