背景及概述[1]
末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(terminal deoxyribonucleotidyl transferase,TdT,簡(jiǎn)稱末端轉(zhuǎn)移酶)，是從動(dòng)物(通常是牛) 胸腺和骨髓中分離提取的。末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）是一種不依賴于模板的DNA聚合酶，催化脫氧核苷酸結(jié)合到DNA分子的3’羥基端。帶有突出、凹陷或平滑末端的單雙鏈DNA分子均可作為TdT的底物，加尾長(zhǎng)度可達(dá)5~300nt。該末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）分子量為58.3 kDa，無(wú)5’和3’核酸外切酶活性，反應(yīng)中加入Co2+可提高加尾效率。該酶廣泛用于DNA的3’末端添加同聚物、利用修飾堿基（如ddNTP，DIGdUTP）標(biāo)記DNA 3’末端、TdT介導(dǎo)的dUTP 缺口末端標(biāo)記技術(shù)（細(xì)胞凋亡的原位檢測(cè)）等試驗(yàn)。該酶經(jīng)檢測(cè)無(wú)DNA內(nèi)切酶和外切酶污染，不含RNase。
應(yīng)用[1]
有研究應(yīng)用末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶法（TdT末端轉(zhuǎn)移酶法）研究抗腫瘤藥物誘導(dǎo)人腫瘤細(xì)胞的凋亡。研究表明應(yīng)用TdT法檢測(cè)，在卡鉑治療的卵巢癌患者的腫瘤組織中觀察到了凋亡細(xì)胞。TdT法有可能用于檢測(cè)經(jīng)化療誘導(dǎo)的人腫瘤細(xì)胞的凋亡，以及評(píng)價(jià)治療過(guò)程中腫瘤細(xì)胞對(duì)治療的反應(yīng)。具體應(yīng)用如下：
(1)給載體或CDNA加上互補(bǔ)的同聚尾(用于建立體外重組DNA分子時(shí)在DNA片段末端加上一一個(gè)同聚物尾巴，兩種不同的DNA分子加上不同的但可以互補(bǔ)的即A和T、C和G的尾巴后，經(jīng)過(guò)退火或復(fù)性，兩種尾巴便可以借助互補(bǔ)作用連接在一起)。在CDNA文庫(kù)建立時(shí)，這種加尾方法是使CDNA插人載體中的常用方法之一。
(2)用于DNA片段3'末端的放射性核素標(biāo)記。末端轉(zhuǎn)移酶在Mg2+存在的條件下，選擇3'-OH端單鏈DNA為引物加成核苷酸，在CO+存在的條件下，選擇3'-OH端雙鏈DNA為引物加成核苷酸，形成多聚核苷酸尾。如果在反應(yīng)系統(tǒng)中加人核素標(biāo)記的核苷酸，那么便可得到3'端標(biāo)記的DNA分子。該法常用于核酸末端標(biāo)記和核酸連接的互補(bǔ)多聚尾(連接頭)。
活性定義
37℃60分鐘內(nèi)，催化1nmol dNTP加入到多聚核苷酸3’羥基末端中所需的酶量定義為1個(gè)活性單位 1×TdT Buffer 100mM KCl, 30mM Tris-acera, 0.05% (v/v) Triton X-100 (pH 7.5 at 25℃)
儲(chǔ)存
-20℃可保存3年。
熱失活
75℃20min。
注意事項(xiàng)
1、適量EDTA可使Terminal Transferase的活性喪失。
2、金屬離子螯合劑，較高濃度的銨根離子、氯離子、碘例子和磷酸根離子均對(duì)Terminal Transferase活性具有抑制作用。
主要參考文獻(xiàn)
[1] 童彤, 孫含笑, 劉麗影, 等. 應(yīng)用末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶法研究化療藥誘導(dǎo)人腫瘤細(xì)胞的凋亡[D]. , 1997.