背景[1-3]
RSC96(大鼠雪旺細(xì)胞)是大鼠雪旺細(xì)胞（Schwann cells）的一種，被廣泛應(yīng)用于神經(jīng)科學(xué)研究領(lǐng)域。這種細(xì)胞系通常是從大鼠的神經(jīng)組織中提取并培養(yǎng)得到的，具有神經(jīng)細(xì)胞樣的生長(zhǎng)特性和形態(tài)。
RSC96細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中，通常使用DMEM（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）培養(yǎng)基，并添加10%胎牛血清（FBS）和1%的抗生素/抗霉菌劑（P/S）來(lái)維持細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活。細(xì)胞的傳代比例通常在1:3至1:4之間，換液頻率建議為2~3次/周。
RSC96(大鼠雪旺細(xì)胞)
RSC96(大鼠雪旺細(xì)胞)培養(yǎng)操作
1)復(fù)蘇NCI-H647人非小細(xì)胞肺癌貼壁細(xì)胞系細(xì)胞
將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10cm皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過(guò)夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2)RSC96(大鼠雪旺細(xì)胞)傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。
b、加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
c、按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
d、將細(xì)胞懸液按1：2比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
3)RSC96(大鼠雪旺細(xì)胞)凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。下面T25瓶為例；
a、收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，裝入無(wú)菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。
b、根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入無(wú)血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識(shí)。
c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
應(yīng)用[4-5]
RSC96(大鼠雪旺細(xì)胞)可以用于葛根素調(diào)控Nrf2/SLC7A11/GPX4通路抑制H2O2誘導(dǎo)的RSC96細(xì)胞鐵死亡
探討葛根素對(duì)H2O2誘導(dǎo)的RSC96細(xì)胞鐵死亡的保護(hù)作用及其機(jī)制。
方法:將RSC96(大鼠雪旺細(xì)胞)體外培養(yǎng),隨機(jī)分成4組:正常組(Control,Con)、模型組(H2O2)、葛根素干預(yù)組(H2O2+Pue)和抑制劑組(H2O2+Pue+ML385)。采用如下實(shí)驗(yàn):1.將RSC96(大鼠雪旺細(xì)胞)用0～0.75 m M H2O2進(jìn)行處理,Western blot檢測(cè)GPX4和PTGS2蛋白表達(dá),以測(cè)定H2O2造模濃度及干預(yù)時(shí)間。
2. 將RSC96(大鼠雪旺細(xì)胞)用0.25～1 m M葛根素進(jìn)行預(yù)處理后,加入0.3 m M H2O2干預(yù)RSC96細(xì)胞24h,CCK-8檢測(cè)細(xì)胞存活率,以確定葛根素干預(yù)濃度。
3.Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞中SLC7A11、GPX4、Nrf2和HO-1蛋白水平。
4.生化方法檢測(cè)GSH、MDA、T-SOD、ROS和Fe2+水平。
5.免疫熒光法觀察Nrf2蛋白共定位情況。
結(jié)果:1.與Con組相比,0.3 m M H2O2處理RSC96(大鼠雪旺細(xì)胞)24 h,GPX4的蛋白水平顯著下降(P<0.05),PTGS2蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01),提示RSC96細(xì)胞鐵死亡模型造模成功。
3. CCK-8結(jié)果顯示,與Con組相比,H2O2組的細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.01);與H2O2組相比,500μM葛根素預(yù)處理RSC96(大鼠雪旺細(xì)胞)30 min,細(xì)胞存活率顯著升高(P<0.01)。
3.WB結(jié)果顯示,與H2O2組相比,H2O2+Pue組GPX4、SLC7A11、HO-1和Nrf2蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.05或P<0.01)。
4.生化檢測(cè)結(jié)果顯示,與Con組相比,H2O2組RSC96細(xì)胞GSH和SOD水平顯著降低(P<0.05或P<0.01),ROS和MDA水平明顯增加(P<0.05或P<0.01);與H2O2組相比,H2O2+Pue組細(xì)胞內(nèi)GSH和SOD水平顯著增加(P<0.05或P<0.01),ROS和MDA積累顯著下降(P<0.05或P<0.01)。
5.免疫熒光結(jié)果顯示,與H2O2相比,H2O2+Pue組共定位系數(shù)顯著增加(P<0.05),而這種作用可被Nrf2蛋白的抑制劑ML385所抑制。
結(jié)論:葛根素對(duì)H2O2誘導(dǎo)的RSC96(大鼠雪旺細(xì)胞)鐵死亡具有保護(hù)作用,其機(jī)制可能是通過(guò)激活Nrf2/SLC7A11/GPX4信號(hào)通路,抑制脂質(zhì)過(guò)氧化實(shí)現(xiàn)的。
參考文獻(xiàn)
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