背景[1-3]
人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞是一種來源于神經(jīng)系統(tǒng)的惡性腫瘤細(xì)胞，通常在腦組織中發(fā)生。它們具有高度異質(zhì)性和侵襲性，能夠快速增殖并擴散到周圍組織和器官。
人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞可以分為多種類型，包括星形細(xì)胞瘤、少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤、髓母細(xì)胞瘤等。這些類型的腫瘤細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上有所不同，但都具有惡性生長的特征。
人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長受到多種因素的影響，包括基因突變、環(huán)境因素、免疫系統(tǒng)等。目前尚無完全治愈人神經(jīng)膠質(zhì)瘤的方法，治療主要是通過手術(shù)切除、放療和化療等方式來控制腫瘤的生長和擴散。
人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞
一．人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：
1）準(zhǔn)備1640（推薦YJ-0002）培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%；雙抗，1%。
2）培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。
3）凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。
二．人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞處理：
1）凍存細(xì)胞的復(fù)蘇：
將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含4-6mL完全培養(yǎng)基的離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。然后將細(xì)胞懸液加入含6-8ml完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶（或皿）中37℃培養(yǎng)過夜。第二天顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況和細(xì)胞密度。
2）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。
對于貼壁細(xì)胞傳代可以參考以下方法：
1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。
2.加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培養(yǎng)瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘（難消化的細(xì)胞可以適當(dāng)延長消化時間），然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入3-4ml含10%FBS的培養(yǎng)基來終止消化。
3.輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。將細(xì)胞懸液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照說明書要求配置的新的完全培養(yǎng)基以保持細(xì)胞的生長活力，后續(xù)傳代根據(jù)實際情況按1:2~1:5的比例進行。
3）人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞細(xì)胞凍存:收到細(xì)胞后建議在培養(yǎng)前3代時凍存一批細(xì)胞種子以備后續(xù)實驗使用。
1.細(xì)胞凍存時按照細(xì)胞傳代的過程收集消化好的細(xì)胞到離心管中，可使用血球計數(shù)板計數(shù)，來決定細(xì)胞的凍存密度。一般細(xì)胞的推薦凍存密度為1×106~1×107個活細(xì)胞/ml.
2.1000rpm離心3-5min，去掉上清。用配制好的細(xì)胞凍存液重懸細(xì)胞，按每1ml凍存液含1×106~1×107個活細(xì)胞/ml分配到一個凍存管中將細(xì)胞分配到凍存管中，標(biāo)注好名稱、代數(shù)、日期等信息。
3.將要凍存的細(xì)胞置于程序降溫盒中，-80度冰箱中過夜，之后轉(zhuǎn)入液氮容器中儲存。同時記錄好凍存管在液氮容器中的位置以便后續(xù)查閱和使用。
應(yīng)用[4-5]
人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞可以用于FePt納米粒子誘導(dǎo)人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的機制研究
神經(jīng)膠質(zhì)瘤是具有極高死亡率的一種高度惡性腦腫瘤,它的一般治療方法包括外科手術(shù)切除,納米粒子做藥物放化療等。FePt納米粒子具有優(yōu)異的超順磁性,目前,已被用作MRI造影劑用于檢測腫瘤細(xì)胞。在之前的有關(guān)FePt納米粒子的研究中,我們合成出表面有油胺-油酸包被的FePt納米粒子,并將FePt納米粒子與U251細(xì)胞共培養(yǎng)后通過MTT檢測檢測細(xì)胞的存活率,實驗已經(jīng)證實FePt納米粒子可以抑制U251細(xì)胞的增殖,然而具體作用機理尚未明確。因此,本研究旨在探討FePt納米粒子誘導(dǎo)U251細(xì)胞凋亡的作用及機制研究。
本文首先通過TEM對FePt納米粒子進行分散性和粒徑分布的表征,結(jié)果顯示,FePt納米粒子分散性較好,且粒徑較為均一,在10 nm以下。然后通過CCK-8試劑盒檢測了0.1、1、5、25和75μg/m L的FePt納米粒子與U251細(xì)胞共培養(yǎng)6、12、24、48和72 h后,細(xì)胞存活率的變化;通過LDH釋放試劑盒檢測了共培養(yǎng)后細(xì)胞膜完整性的變化;通過Hoechst-PI雙重染色以及流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡定性定量觀察了共培養(yǎng)后U251細(xì)胞的凋亡情況。
結(jié)果表明,FePt納米粒子能顯著誘導(dǎo)U251細(xì)胞凋亡,且不同濃度FePt納米粒子與U251細(xì)胞作用不同時間后,U251細(xì)胞的凋亡狀況明顯不同,當(dāng)作用時間較短時,高濃度FePt納米粒子誘導(dǎo)U251細(xì)胞凋亡更為顯著,其中,5μg/m L FePt納米粒子與U251細(xì)胞培養(yǎng)24 h時,細(xì)胞凋亡程度最為顯著,同時隨著培養(yǎng)時間延長,低濃度FePt納米粒子對U251細(xì)胞增殖的抑制作用逐漸顯現(xiàn)。
接著,本文通過流式細(xì)胞術(shù)檢測了FePt納米粒子對U251細(xì)胞周期阻滯情況;通過各氧化應(yīng)激酶(SOD,CAT,GPx)以及氧化損傷產(chǎn)物(MDA)檢測試劑盒檢測了細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激狀態(tài)的變化。通過蛋白免疫印跡檢測了與細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白p53,Bcl-2,Bax表達水平的變化。
結(jié)果表明,U251用FePt納米粒子處理后,U251細(xì)胞周期大多被阻滯在G0/G1期,S期和G2/M期細(xì)胞數(shù)目下調(diào),同時,U251細(xì)胞中SOD,CAT,GPx活性均不同程度的下降,MDA含量增多,細(xì)胞質(zhì)中ROS大量累積,抑癌基因p53表達減少,導(dǎo)致抗凋亡蛋白Bcl-2表達減少,促凋亡蛋白Bax表達變多,細(xì)胞凋亡增多,即在分子水平上證明了FePt納米粒子進入細(xì)胞后,通過調(diào)制細(xì)胞周期,損傷DNA、線粒體的內(nèi)凋亡途徑誘導(dǎo)U251細(xì)胞凋亡。
參考文獻
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