背景[1-3]
ND723鼠神經(jīng)母細胞瘤細胞系是一種鼠神經(jīng)母細胞瘤細胞系，通常用于神經(jīng)科學和神經(jīng)腫瘤學的研究。這種細胞系是由神經(jīng)母細胞瘤細胞系ND7經(jīng)過亞克隆形成的，具有穩(wěn)定的遺傳學特性和腫瘤特征。
ND7/23細胞系通常用于研究神經(jīng)母細胞瘤的發(fā)生、發(fā)展、治療和藥物篩選等方面的實驗。這些研究有助于深入了解神經(jīng)母細胞瘤的生物學特性和治療策略，為臨床診斷和治療提供重要的參考依據(jù)。
ND7/23鼠神經(jīng)母細胞瘤細胞系是一種來源于小鼠的神經(jīng)母細胞瘤細胞系。該細胞系具有以下特點：
來源于小鼠：ND7/23細胞系來源于小鼠，因此具有與小鼠神經(jīng)母細胞瘤相似的形態(tài)和生理特性。
高度惡性：ND7/23細胞系是一種高度惡性的腫瘤細胞系，可以在體外快速增殖并形成腫瘤。
可傳代性好：ND7/23細胞系具有較高的傳代穩(wěn)定性，可以在體外連續(xù)培養(yǎng)和擴增。
可誘導分化：ND7/23細胞系可以被誘導分化為多種不同類型的細胞，如神經(jīng)元、膠質(zhì)細胞等，這為研究神經(jīng)母細胞瘤的發(fā)生和發(fā)展提供了便利。
ND7-23鼠神經(jīng)母細胞瘤細胞系
ND7/23鼠神經(jīng)母細胞瘤細胞系細胞培養(yǎng)操作
1)復蘇ND7/23鼠神經(jīng)母細胞瘤細胞系細胞：以下細胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說明書為主。
將含有1 mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓毎麘乙杭尤?0 cm皿中，加入約8 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細胞密度。
2)ND7/23鼠神經(jīng)母細胞瘤細胞系細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。
a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。
b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤所有細胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 min，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
c、按6-8 mL/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。
d、將細胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
3)ND7/23鼠神經(jīng)母細胞瘤細胞系細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存。下面T25瓶為例；
a、收集細胞及細胞培養(yǎng)液，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進行細胞計數(shù)。
b、根據(jù)細胞數(shù)量加入無血清細胞凍存液，使細胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細胞懸液，注意凍存管做好標識。
c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
應用[4-5]
ND7/23鼠神經(jīng)母細胞瘤細胞系可以用于PINK1/Parkin途徑的線粒體自噬受損在高糖引發(fā)感覺神經(jīng)元氧化損傷中的作用
利用小鼠神經(jīng)母細胞瘤和大鼠DRG雜交的細胞株(ND7/23鼠神經(jīng)母細胞瘤細胞系)探究在高糖環(huán)境下,PINK1/Parkin途徑的線粒體自噬受損在引發(fā)感覺神經(jīng)元氧化損傷中的作用,為預防與治療DPNP提供一定理論依據(jù)。
研究目的:1.觀察不同濃度葡萄糖處理不同時間對ND7/23鼠神經(jīng)母細胞瘤細胞系細胞線粒體自噬及氧化損傷的影響,建立高糖損傷模型。
2. 通過調(diào)控PINK1的表達,探究PINK1/Parkin途徑的線粒體自噬受損在高糖中引發(fā)感覺神經(jīng)元氧化損傷的機制。
研究方法:1.測定ND7/23鼠神經(jīng)母細胞瘤細胞系細胞在葡萄糖濃度梯度(25mM、50mM、75mM)以及時間梯度(24 h、48 h、72 h)干預后細胞活力的變化,通過western blot檢測葡萄糖濃度梯度以及時間梯度干預后PINK1/Parkin途徑的線粒體自噬關(guān)鍵蛋白和凋亡相關(guān)蛋白的表達變化;通過免疫熒光檢測ND7/23細胞高糖下COXIV-LC3B(自噬體形成)和COXIV-LAMP1(自噬溶酶體形成)的共定位的情況、線粒體自噬、線粒體膜電位和線粒體ROS水平。最終確定模型的最佳葡萄糖濃度與干預時間。
3. 通過轉(zhuǎn)染siRNA的方式敲低ND7/23鼠神經(jīng)母細胞瘤細胞系細胞PINKI表達,分組設置為:陰性對照siRNA對照組;PINK1-siRNA對照組;陰性對照siRNA的高糖組;PINKl-siRNA的高糖組。測定各組細胞活力的變化,通過western blot檢測PINK1/Parkin途徑的線粒體自噬關(guān)鍵蛋白和凋亡相關(guān)蛋白的表達變化;通過免疫熒光檢測COXIV-LC3B和COXIV-LAMPI的共定位的情況、線粒體自噬、線粒體膜電位和線粒體ROS水平。
研究結(jié)果:1.建立線粒體自噬受損高糖體外模型(50mM葡萄糖,干預48h),其PINK1表達、Parkin磷酸化程度降低、線粒體自噬受抑制、凋亡激活、線粒體膜電位下降、線粒體ROS增加。
2. 抑制PINKI表達后,高糖下ND7/23鼠神經(jīng)母細胞瘤細胞系細胞線粒體自噬進一步受抑制、凋亡激活、線粒體膜電位進一步下降、線粒體ROS進一步增加。
研究結(jié)論:1.在高糖下,PINKI/Parkin途徑的線粒體自噬受損,會導致線粒體功能障礙加重,導致ND7/23鼠神經(jīng)母細胞瘤細胞系細胞氧化損傷,激活細胞凋亡通路。
2.抑制PINKI表達降低了Parkin磷酸化的比例,使線粒體功能障礙進一步加重,加重線粒體自噬受損程度,加重氧化損傷程度,激活細胞凋亡通路。
參考文獻
[1]XBP1 deficiency promotes hepatocyte pyroptosis by impairing mitophagy to activate mtDNA-cGAS-STING signaling in macrophages during acute liver injury[J].Liu Zheng;Wang Mingming;Wang Xun;Bu Qingfa;Wang Qi;Su Wantong;Li Lei;Zhou Haoming;Lu Ling.Redox Biology,2022
[2]Poly(ADP-ribose)polymerase 1-mediated defective mitophagy contributes to painful diabetic neuropathy in the db/db model.[J].Yuan Pengfei;Song Fuhu;Zhu Pian;Fan Keke;Liao Qinming;Huang Lijin;Liu Zhongjie.Journal of neurochemistry,2022
[3]Current views of diabetic peripheral neuropathic pain comorbid depression-a review.[J].Wei KS;Gu MZ;Zhu JW;Hu HC;Yin LP.European review for medical and pharmacological sciences,2020
[4]Challenges of neuropathic pain:focus on diabetic neuropathy.[J].Rosenberger Daniela C;;Blechschmidt Vivian;;Timmerman Hans;;Wolff André;;Treede Rolf-Detlef.Journal of neural transmission(Vienna,Austria:1996),2020
[5]陳畯.PINK1/Parkin途徑的線粒體自噬受損在高糖引發(fā)感覺神經(jīng)元氧化損傷中的作用[D].南方醫(yī)科大學,2023.