背景[1-3]
細胞色素氧化酶染色液(聯(lián)苯胺法)是一種用于檢測細胞色素氧化酶活性的染色方法。細胞色素氧化酶是一種重要的酶，參與細胞呼吸鏈中的電子傳遞過程，對細胞能量代謝起著關鍵作用。通過檢測細胞色素氧化酶的活性，可以了解細胞的代謝狀態(tài)和功能。
聯(lián)苯胺法是一種常用的細胞色素氧化酶染色方法。該方法利用聯(lián)苯胺作為底物，在細胞色素氧化酶的催化下，發(fā)生氧化反應并生成有色產(chǎn)物。通過觀察有色產(chǎn)物的形成情況，可以判斷細胞色素氧化酶的活性水平。
細胞色素氧化酶染色液（聯(lián)苯胺法）通常包含聯(lián)苯胺、緩沖液和其他輔助成分。在使用時，將染色液滴加到待檢測的細胞樣本上，經(jīng)過一定時間的反應后，觀察細胞樣本的染色情況。根據(jù)染色的深淺和分布情況，可以判斷細胞色素氧化酶的活性水平。
細胞色素氧化酶是線粒體中的一種重要酶類，它參與呼吸鏈中的電子傳遞過程，并產(chǎn)生細胞能量。在病理狀態(tài)下，如心肌缺血、肝炎等疾病中，細胞色素氧化酶的活性會發(fā)生變化，因此檢測其活性可以作為診斷和評估疾病進展的指標之一。
細胞色素氧化酶
細胞色素氧化酶染色液(聯(lián)苯胺法)的制備方法如下：
準備試劑：將聯(lián)苯胺溶于無水乙醇中，制成0.5%的溶液。另外，還需要準備檸檬酸緩沖液(pH 6.0)和亞硝基鐵氰化鈉溶液。
取適量的待檢組織或細胞樣本，加入適量的檸檬酸緩沖液(pH 6.0)，用勻漿器將組織或細胞充分打碎。
將勻漿液離心，去除上清液，留下沉淀物。
將沉淀物加入到含有聯(lián)苯胺溶液的試管中，輕輕搖晃試管，使聯(lián)苯胺充分與沉淀物接觸。
加入適量的亞硝基鐵氰化鈉溶液，輕輕搖晃試管，使反應混合物充分混合。
在室溫下靜置反應10-15分鐘，或者在37°C下反應30分鐘。
用顯微鏡觀察染色結果，并記錄下染色情況。
應用[4-5]
細胞色素氧化酶染色液（聯(lián)苯胺法）可以用于低毒殺鼠煙劑篩選及植物提取物對達烏爾黃鼠細胞色素氧化酶活性的影響
對殺鼠煙劑進行動物實驗,以小白鼠為實驗對象;在植物實驗中,采取了3種方法,第一是以月季花瓣為實驗材料進行了退色實驗,第二是以蠶豆幼苗為實驗材料進行敏感植物實驗;第三是以楊樹為實驗材料進行植物生理指標實驗。在篩選殺鼠煙劑時,采用室內實驗的方法,對其防火包裝材料進行了篩選。在不同中藥的乙醇粗提物對達烏爾黃鼠心臟細胞色素氧化酶活性影響的實驗中,使用細胞色素氧化酶染色液（聯(lián)苯胺法）篩選出對達烏爾黃鼠心臟細胞色素氧化酶活性影響較大中藥提取物,為植物性殺鼠劑的篩選提供了一條新的思路。
研究結果如下:在殺鼠煙劑篩選方面,(1)通過篩選,最后篩選出CO殺鼠煙劑配方①和②、雙層殺鼠煙劑配方②和③、和呋喃丹殺鼠煙劑配方①和②都是可取的殺鼠煙劑配方;氯化銨殺鼠煙劑應有選擇性的使用;需要改進的配方是狼毒殺鼠煙劑配方①和②、雙層殺鼠煙劑配方①和呋喃丹殺鼠煙劑配方③。
(2)在殺鼠煙劑防火包裝材料篩選方面,篩選出14個配方,其中7個配方組成成分簡單,容易配制,為優(yōu)選配方;另外7種配方組成成分較多,配制不便,為候選配方。在中藥粗提物對細胞色素氧化酶活性影響程度的篩選方面,對118種中藥進行乙醇浸提,使用細胞色素氧化酶染色液（聯(lián)苯胺法）測定這些中藥的乙醇提取物對達烏爾黃鼠心臟細胞色素氧化酶活性的影響,結果表明,(1)將118種中藥提取物對達烏爾黃鼠心臟細胞色素氧化酶活性的影響結果作方差分析,表明這118種中藥提取物對達烏爾黃鼠細胞色素氧化酶活性影響的F值在4個濃度條件下都大于F0.05,存在顯著的差異。
在1×10-3 kg.L-1濃度下有9種中藥提取物對達烏爾黃鼠心臟細胞色素氧化酶活性有抑制作用,抑制率超過50%,這9種中藥提取物有蘇子、熟地黃、敗醬草、三棱、白鮮皮、蘇合香、葛根、決明子和女貞子;在1×10-2 kg.L-1濃度下有3種中藥提取物對達烏爾黃鼠心臟細胞色素氧化酶活性有抑制作用,抑制率超過50%,這3種中藥提取物為敗醬草、三棱和葛根。
(3)將118種中藥提取物對達烏爾黃鼠心臟細胞色素氧化酶活性的細胞色素氧化酶染色液（聯(lián)苯胺法）結果進行聚類分析,把118種中藥提取物分為10個類群,其中類群1有43種中藥提取物,類群2有12種中藥提取物,類群3有34種中藥提取物,類群4有17種中藥提取物,類群5有7種中藥提取物,類群6至類群10各有1種中藥提取物。
參考文獻
[1]Mito-controversies:Mitochondrial Permeability Transition Pore and Myocardial Reperfusion Injury[J].Hemal H.Patel;;Yasuo M.Tsutsumi;;David M.Roth.Anesthesiology,2008(2)
[2]Relative effects of exercise training and alendronate treatment on skeletal muscle function of ovariectomized rats[J].Jeffrey J.Widrick;;Robyn Fuchs;;Gianni F.Maddalozzo;;Kevin Marley;;Christine Snow.Menopause,2007(3)
[3]Bimodal actions of reactive oxygen species in the differentiation and bone-resorbing functions of osteoclasts[J].Hyunsoo Kim;;Ick Young Kim;;Soo Young Lee;;Daewon Jeong.FEBS Letters,2006(24)
[4]Free radicals-mediated damage in transmitochondrial cells harboring the T14487C mutation in the ND6 gene of mtDNA[J].Ricardo Gonzalo;;Elena Garcia-Arumi;;David Llige;;Ramon Marti;;Abelardo Solano;;Julio Montoya;;Joaquín Arenas;;Antonio L.Andreu.FEBS Letters,2005(30)
[5]梁偉坡.低毒殺鼠煙劑篩選及植物提取物對達烏爾黃鼠細胞色素氧化酶活性的影響[D].河北農(nóng)業(yè)大學,2006.