背景及概述^[1]

shRNA文庫構(gòu)建為構(gòu)建RNAi文庫的中間環(huán)節(jié)，RNA干擾(RNAinterference，RNAi)在絕大多數(shù)真核生物中是一種保守的調(diào)控基因表達(dá)的機(jī)制，生物體內(nèi)長(zhǎng)鏈dsRNA(DoublestrandRNA，dsRNA)經(jīng)過類RNaseIII的核酸內(nèi)切酶Dicer/DCLs加工處理成21−24ntsiRNA(SmallinterferenceRNA，siRNA)，隨后siRNA進(jìn)入RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RISC)，實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因的特異性降解，即PTGS(Post-transcriptionalgenesilencing)。shRNA(shorthairpinRNA，小發(fā)卡RNA)介導(dǎo)的RNA干擾(RNAinterference，RNAi)技術(shù)逐漸成為哺乳動(dòng)物功能基因研究的重要途徑和方法，以其為基礎(chǔ)的RNAi文庫技術(shù)將會(huì)大大提升RNAi功效，為開展大規(guī)模、高通量的基因功能。有研究利用DNA酶學(xué)工程方法(SmallinterferingRNAproductionbyenzymaticengineeringofDNA，SPEED)構(gòu)建了小鼠胚胎siRNA文庫，其中包含shRNA文庫構(gòu)建過程。

shRNA文庫構(gòu)建過程如下：該方法是基于內(nèi)切酶MmeI[TCCRAC(N)20]能夠在距離識(shí)別位點(diǎn)20bp處切割雙鏈DNA，從而形成含有20bp的短發(fā)卡結(jié)構(gòu)DNA，該結(jié)構(gòu)可以在體內(nèi)轉(zhuǎn)錄為短的發(fā)卡RNA(ShorthairpinRNA，shRNA)。該方法首先將目的DNA片段用識(shí)別4堿基的內(nèi)切酶(AciI，HpaI，HpyCH4IV，HinPI，TaqI)進(jìn)行消化，產(chǎn)生出粘性末端相同但長(zhǎng)度不等的DNA片段，然后與人工合成的43nt具有小發(fā)卡結(jié)構(gòu)的寡核苷酸片段相連，連接產(chǎn)物經(jīng)MmeI酶切并回收形成單鏈形態(tài)的發(fā)卡DNA(HairpinDNA，hpDNA)，然后與人工合成的寡核苷酸片段連接，隨后在BstDNA聚合酶作用下，通過引物延伸和鏈置換使單鏈hpDNA轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂蟹聪蛑貜?fù)結(jié)構(gòu)的dsDNA，通過合適的酶切位點(diǎn)消化后將它們克隆到表達(dá)載體上。利用該方法建立的shRNA文庫含有3.0×106個(gè)克隆。

主要參考資料

[1] RNA干擾(RNAi)文庫研究進(jìn)展