背景^[1-3]

小鼠骨髓單核細(xì)胞（Mouse Bone Marrow Mononuclear Cells，簡稱BMSCs）是來源于小鼠骨髓的一種干細(xì)胞，具有自我更新、多向分化潛能和低免疫原性等特點(diǎn)。BMSCs在組織工程、細(xì)胞治療、藥物篩選和疾病模型等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。

小鼠骨髓單核細(xì)胞可以從骨髓中分離得到，通過貼壁培養(yǎng)法或流式細(xì)胞術(shù)等方法進(jìn)行分離純化。這些細(xì)胞具有高度的增殖能力，能夠在體外培養(yǎng)條件下進(jìn)行大量擴(kuò)增。同時(shí)，BMSCs還具有多向分化潛能，可以在特定誘導(dǎo)條件下分化為骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌肉細(xì)胞等。

除了自我更新和多向分化潛能外，小鼠骨髓單核細(xì)胞還具有低免疫原性，可以用于異體移植治療，避免了免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生。此外，BMSCs還具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)和組織修復(fù)等功能，可以用于治療多種疾病，如糖尿病、神經(jīng)退行性疾病、肝病和骨關(guān)節(jié)炎等。

需要注意的是，小鼠骨髓單核細(xì)胞的分離和培養(yǎng)需要嚴(yán)格的無菌條件和操作技術(shù)，以保證細(xì)胞的純度和安全性。同時(shí)，對于細(xì)胞的用途和安全性需要進(jìn)行充分的評估和驗(yàn)證，以確保其在臨床和科研領(lǐng)域的應(yīng)用價(jià)值。

小鼠骨髓單核細(xì)胞

小鼠骨髓單核細(xì)胞培養(yǎng)操作

1)復(fù)蘇小鼠骨髓單核細(xì)胞：以下細(xì)胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說明書為主。

將含有1 mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10 cm皿中，加入約8 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2)小鼠骨髓單核細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤所有細(xì)胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

c、按6-8 mL/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。

d、將細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3)小鼠骨髓單核細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。下面T25瓶為例；

a、收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

b、根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入無血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識。

c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

應(yīng)用^[4-5]

小鼠骨髓單核細(xì)胞可以用于高脂飲食誘導(dǎo)下C57BL/6J小鼠外周血、骨髓單核細(xì)胞及骨髓造血干細(xì)胞的變化特點(diǎn)及機(jī)制研究

高脂飲食對C57BL/6J小鼠骨髓造血干細(xì)胞的影響目的外周血和骨髓中的單核細(xì)胞主要來源于骨髓中的普通髓系祖細(xì)胞,如第一部分所示,高脂飲食時(shí),外周血中單核細(xì)胞呈早期減少,后期增加,骨髓單核細(xì)胞早期無變化,后期增加,那么,高脂飲食是否對骨髓造血干細(xì)胞有影響,這種影響是否參與了外周循環(huán)單核細(xì)胞的變化，故本研究在前一步部分的基礎(chǔ)上,觀察高脂飲食下,不同時(shí)期小鼠骨髓單核細(xì)胞和及其前體骨髓造血干細(xì)胞的變化情況,來探討肥胖發(fā)生發(fā)展過程中,血中小鼠骨髓單核細(xì)胞變化的來源及機(jī)制。

方法：5-6周齡的C57BL/6J小鼠經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,隨機(jī)分為兩組,高脂飲食組予60%脂肪飼料,低脂飲食組予10%脂肪飼料,分別于3天,7天,15天,15周和19周時(shí),每組各取5只小鼠(19周10只),頸椎脫臼法處理小鼠后,分離其四肢脛骨,剪刀剪斷兩斷,1.5ml注射器(27#或25#針頭)吸取1mlFACS沖洗骨髓細(xì)胞于5ml EP管中,加入紅細(xì)胞裂解液,4℃C離心機(jī)15000rpm離心5分鐘,最后加入500μl FACS重懸細(xì)胞,取100μl骨髓細(xì)胞進(jìn)行抗體標(biāo)記,先每組加入2μ1CD16/32-FITC阻斷Fcr受體,lin-抗體(每管每種抗體2μl,共12μl),冰上孵育30分鐘后,FACS沖洗,再加入不同的抗體,Qdot-605-Lin-,APC-CD11b,PE-c-kit,AlexaFlour430-CD34,FITC-CD16/32,Percp-Cy5-5-Flt3標(biāo)記骨髓造血干細(xì)胞,冰上孵育30分鐘后,加入FACS,4℃離心機(jī)15000rpm離心5分鐘洗滌細(xì)胞后,加入500μl FACS重懸細(xì)胞,同時(shí)設(shè)立對照管,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞,Flowjo7.0軟件處理圖像,Prism 7.0進(jìn)入數(shù)據(jù)處理,結(jié)果以X±平均數(shù)表示,統(tǒng)計(jì)方法采用兩個(gè)樣本的獨(dú)立t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理,P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果：骨髓造血干細(xì)胞各亞群細(xì)胞（小鼠骨髓單核細(xì)胞）占骨髓Lin-百分比的變化特點(diǎn):1)Lin-細(xì)胞群:第15天時(shí),高脂飲食組Lin-細(xì)胞群細(xì)胞數(shù),與低脂組相比減少,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05);2)sacl-ckit+細(xì)胞群,第3天、15周時(shí)兩組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,高脂飲食組細(xì)胞數(shù)減少(P<0.05);3)CMP細(xì)胞群:兩組相比,第3天時(shí),高脂飲食組百分比較低脂組較多,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),GMP群7兩組間整個(gè)實(shí)驗(yàn)時(shí)間段,兩組相比,無差異;4)LT-HSC細(xì)胞群,第7天時(shí),兩組細(xì)胞數(shù)相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),其中高脂飲食組明顯減低;5)MPP細(xì)胞群,兩組間相比,第15天時(shí),高脂飲食組較低脂飲食組減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);5)19周時(shí),兩組相比,整個(gè)骨髓造血干細(xì)胞各亞群無明顯差異(P>0.05)。

參考文獻(xiàn)

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