簡述
安絲菌素 P 3是一種隸屬于屬于安莎類抗生素范圍的化學(xué)物質(zhì)，分子式為C32H43ClN2O9，分子量為635.14，外觀為白色固體粉末，具有抗腫瘤、抗結(jié)核桿菌、抗細(xì)菌等多種藥理活性[1]。
根據(jù)現(xiàn)有的文獻(xiàn)來看，安絲菌素 P 3主要通過微生物發(fā)酵進(jìn)行生產(chǎn)，生產(chǎn)工藝屬于典型的抗生素發(fā)酵工藝。目前，國內(nèi)對該化合物的創(chuàng)新性研究很少，而國外研究很熱，每年發(fā)表文獻(xiàn)數(shù)量逐年上升。我國有四川大學(xué)、上海交大等多家單位和醫(yī)藥公司都在進(jìn)行安絲菌素的發(fā)酵工藝開發(fā)，其組分有P-0、P-1、P-2、P-3、P-3'、P-4和P-4'，其中安絲菌素P-3為主要合成產(chǎn)物，他通過阻礙微管形成從而阻止細(xì)胞的有絲分裂使細(xì)胞死亡，在體外及荷瘤動物中具有顯著抗腫瘤作用。
生產(chǎn)研究
作為理想的靶向化藥物的毒性物，安絲菌素 P 3在新型抗腫瘤藥物抗體偶聯(lián)物研究中備受關(guān)注。2013年羅氏抗體藥物偶聯(lián)物Kadcyla被FDA批準(zhǔn)用于治療HER-2陽性晚期轉(zhuǎn)移性乳腺癌。此外，還有SAR3419,BT062,BAY94-9343等多個美登素類偶聯(lián)物也都處于Ⅰ～Ⅱ期臨床試驗(yàn)階段，取得了顯著的臨床效果。目前，安絲菌素 P 3發(fā)酵水平低下，且市場價格昂貴，嚴(yán)重限制了對其進(jìn)一步藥理研究及應(yīng)用。因此對珍貴橙色束絲放線菌發(fā)酵過程進(jìn)行優(yōu)化與調(diào)控以提高A安絲菌素 P 3發(fā)酵水平具有積極的現(xiàn)實(shí)意義。以珍貴橙色束絲放線菌APSP-01為研究菌株，對其發(fā)酵生產(chǎn)安絲菌素 P 3的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，并對其進(jìn)行放大研究，建立發(fā)酵動力學(xué)模型，確定最佳流加培養(yǎng)策略得出以下結(jié)論： 采用單因素試驗(yàn)與均勻設(shè)計相結(jié)合的方法對化合物發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化。首先采用單因素試驗(yàn)法考察了培養(yǎng)基中碳源，有機(jī)氮源和銨鹽等成分對產(chǎn)物產(chǎn)量的影響，然后采用均勻?qū)嶒?yàn)設(shè)計U*15(157)對其進(jìn)一步進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：葡萄糖4.22%，麥芽糖0.75%，玉米漿3.42%，乙酸銨0.41%，異丁醇0.43%。在最優(yōu)培養(yǎng)基下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到安絲菌素 P 3產(chǎn)量為(51.86±1.33)mg/L，與模型預(yù)測值相符，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了依據(jù)。至于補(bǔ)料策略則確定為：在發(fā)酵約84h，殘?zhí)菨舛冉抵?0g/L以下，采用恒速補(bǔ)料的方式補(bǔ)入流加培養(yǎng)基，在此工藝條件下，發(fā)酵216h，最終安絲菌素 P 3產(chǎn)量達(dá)92.24mg/L，比優(yōu)化前提高了28.11%[2]。
另有文獻(xiàn)報道[3]金屬離子對微生物生長和次級代謝產(chǎn)物至關(guān) 重要，因金屬離子添加被認(rèn)為是一種簡單有效的策略，但是未應(yīng)用于AP-3的生產(chǎn)。研究以提高安絲菌素 P 3產(chǎn)量為目的，首先考察了不同的二價金屬離子對發(fā) 酵過程的影響，篩選出效果最好的金屬離子Mg2+。然后通過添加時間，添加濃度的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)確定最適發(fā)酵條件，使AP-3的產(chǎn)量達(dá)到了85mg/L，是對照 組的3倍。在此基礎(chǔ)上，研究進(jìn)一步分析鎂離子添加對前體，酶活及生物合成基因的影響。在酶水平，測定了聚酮類抗生素生物合成過程中關(guān)鍵酶甲基丙二酰 CoA羧基轉(zhuǎn)移酶和甲基丙二酰CoA異構(gòu)酶的比活，發(fā)現(xiàn)它們均有不同程度的提高。同時檢測到，當(dāng)安絲菌素P 3產(chǎn)量增加時，其生物合成前體丙二酰CoA和 甲基丙二酰CoA的含量顯著降低，從而確定了它們在AP 3生物合成過程中的關(guān)鍵作用。進(jìn)一步通過實(shí)時熒光定量PCR(qRT-PCR)方法，在轉(zhuǎn)錄水平 跟蹤AP 3生物合成相關(guān)基因的表達(dá)量的高低對鎂離子的響應(yīng)。數(shù)據(jù)表明，結(jié)構(gòu)基因asm14，asm24和asm43，以及調(diào)節(jié)基因asm39和 asm40都是上調(diào)的，與AP 3的產(chǎn)量呈正相關(guān)性。研究表明添加鎂離子可以提高安絲菌素 P 3產(chǎn)量，為其它大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的發(fā)酵生產(chǎn)及大規(guī)模培 養(yǎng)提供了參考依據(jù)。
通過應(yīng)用Plackett-Burman設(shè)計和折疊Plackett-Burman設(shè)計以及單因素實(shí)驗(yàn)觀察到異丁醇和銨離子對安絲菌素 P 3的合成過程分別具有正效應(yīng)和負(fù)效應(yīng)。對相關(guān)的培養(yǎng)基進(jìn)行條件優(yōu)化，觀察到銨離子的去除能提高它的產(chǎn)量，但銨離子作為常用氮源及含氮物質(zhì)的中間代謝物，往往在發(fā)酵過程中積累。因此，結(jié)合抗生素的生物合成途徑并從蛋白質(zhì)組學(xué)的角度研究其影響機(jī)制可為銨離子抑制的解除，后續(xù)培養(yǎng)基選擇及代謝途徑改造等提供重要信息。由此，對添加(37 mM)和不添加銨離子的發(fā)酵過程進(jìn)行分析，結(jié)果表明銨離子抑制菌體生長速度，促進(jìn)胞外異丁酸的代謝。從酶活性的檢測數(shù)據(jù)觀察到銨離子在整個發(fā)酵過程中提高纈氨酸代謝的第一個酶纈氨酸脫氫酶的活性，而不像其它抗生素發(fā)酵體系中報道的抑制作用。轉(zhuǎn)錄分析表明大部分產(chǎn)物生物合成基因的轉(zhuǎn)錄水平受銨離子抑制，與產(chǎn)量變化一致。進(jìn)一步應(yīng)用雙向電泳考察蛋白質(zhì)組的響應(yīng)，在pH3-5.6且PAGE濃度為13.5%的雙向電泳條件下獲得約1600個蛋白質(zhì)點(diǎn)，質(zhì)譜鑒定得到12個差異表達(dá)1.5倍以上的蛋白質(zhì)，包括3-磷酸-甘油醛脫氫酶(下調(diào)2倍)，脂肪酸合成酶(上調(diào)1.7倍)，及負(fù)責(zé)絲氨酸生物合成的3-磷酸甘油酸脫氫酶(上調(diào)3.9倍)等。這些結(jié)果顯示銨離子影響脂肪酸和絲氨酸的生物合成，并調(diào)節(jié)安絲菌素 P 3生物合成基因的轉(zhuǎn)錄水平。至于異丁醇，實(shí)驗(yàn)表明異丁醇促進(jìn)安絲菌素 P 3生物合成前體CoA的供應(yīng)，并影響氧化還原相關(guān)的基因和蛋白的表達(dá)水平。這些信息不但為安絲菌素 P 3發(fā)酵操作及其生物合成途徑的改造提供了有益信息，還可為其它大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的發(fā)酵提供借鑒[4]。參考文獻(xiàn)
[1]王石雷,何俊.安絲菌素P-3衍生物及其在制備治療胃癌藥物中的應(yīng)用:CN202110829626.3[P].CN202110829626.3.
[2]朱曉媛.微生物發(fā)酵法制備安絲菌素P-3的研究[D].中南林業(yè)科技大學(xué),2014.DOI:10.7666/d.Y2630573.
[3]賈永亮.鎂離子添加提高抗癌藥物安絲菌素P-3產(chǎn)量的研究[D].華東理工大學(xué),2011.
[4]林錦霞.橙色珍貴束絲放線菌發(fā)酵生產(chǎn)抗癌藥物安絲菌素P-3的研究[J].華東理工大學(xué), 2011.