簡述
安絲菌素 P 3是一種隸屬于屬于安莎類抗生素范圍的化學物質，分子式為C32H43ClN2O9，分子量為635.14，外觀為白色固體粉末，具有抗腫瘤、抗結核桿菌、抗細菌等多種藥理活性[1]。
根據現有的文獻來看，安絲菌素 P 3主要通過微生物發(fā)酵進行生產，生產工藝屬于典型的抗生素發(fā)酵工藝。目前，國內對該化合物的創(chuàng)新性研究很少，而國外研究很熱，每年發(fā)表文獻數量逐年上升。我國有四川大學、上海交大等多家單位和醫(yī)藥公司都在進行安絲菌素的發(fā)酵工藝開發(fā)，其組分有P-0、P-1、P-2、P-3、P-3'、P-4和P-4'，其中安絲菌素P-3為主要合成產物，他通過阻礙微管形成從而阻止細胞的有絲分裂使細胞死亡，在體外及荷瘤動物中具有顯著抗腫瘤作用。
生產研究
作為理想的靶向化藥物的毒性物，安絲菌素 P 3在新型抗腫瘤藥物抗體偶聯物研究中備受關注。2013年羅氏抗體藥物偶聯物Kadcyla被FDA批準用于治療HER-2陽性晚期轉移性乳腺癌。此外，還有SAR3419,BT062,BAY94-9343等多個美登素類偶聯物也都處于Ⅰ～Ⅱ期臨床試驗階段，取得了顯著的臨床效果。目前，安絲菌素 P 3發(fā)酵水平低下，且市場價格昂貴，嚴重限制了對其進一步藥理研究及應用。因此對珍貴橙色束絲放線菌發(fā)酵過程進行優(yōu)化與調控以提高A安絲菌素 P 3發(fā)酵水平具有積極的現實意義。以珍貴橙色束絲放線菌APSP-01為研究菌株，對其發(fā)酵生產安絲菌素 P 3的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，并對其進行放大研究，建立發(fā)酵動力學模型，確定最佳流加培養(yǎng)策略得出以下結論： 采用單因素試驗與均勻設計相結合的方法對化合物發(fā)酵培養(yǎng)基進行了優(yōu)化。首先采用單因素試驗法考察了培養(yǎng)基中碳源，有機氮源和銨鹽等成分對產物產量的影響，然后采用均勻實驗設計U*15(157)對其進一步進行優(yōu)化，確定最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：葡萄糖4.22%，麥芽糖0.75%，玉米漿3.42%，乙酸銨0.41%，異丁醇0.43%。在最優(yōu)培養(yǎng)基下進行驗證試驗，得到安絲菌素 P 3產量為(51.86±1.33)mg/L，與模型預測值相符，為后續(xù)實驗提供了依據。至于補料策略則確定為：在發(fā)酵約84h，殘?zhí)菨舛冉抵?0g/L以下，采用恒速補料的方式補入流加培養(yǎng)基，在此工藝條件下，發(fā)酵216h，最終安絲菌素 P 3產量達92.24mg/L，比優(yōu)化前提高了28.11%[2]。
另有文獻報道[3]金屬離子對微生物生長和次級代謝產物至關 重要，因金屬離子添加被認為是一種簡單有效的策略，但是未應用于AP-3的生產。研究以提高安絲菌素 P 3產量為目的，首先考察了不同的二價金屬離子對發(fā) 酵過程的影響，篩選出效果最好的金屬離子Mg2+。然后通過添加時間，添加濃度的優(yōu)化實驗確定最適發(fā)酵條件，使AP-3的產量達到了85mg/L，是對照 組的3倍。在此基礎上，研究進一步分析鎂離子添加對前體，酶活及生物合成基因的影響。在酶水平，測定了聚酮類抗生素生物合成過程中關鍵酶甲基丙二酰 CoA羧基轉移酶和甲基丙二酰CoA異構酶的比活，發(fā)現它們均有不同程度的提高。同時檢測到，當安絲菌素P 3產量增加時，其生物合成前體丙二酰CoA和 甲基丙二酰CoA的含量顯著降低，從而確定了它們在AP 3生物合成過程中的關鍵作用。進一步通過實時熒光定量PCR(qRT-PCR)方法，在轉錄水平 跟蹤AP 3生物合成相關基因的表達量的高低對鎂離子的響應。數據表明，結構基因asm14，asm24和asm43，以及調節(jié)基因asm39和 asm40都是上調的，與AP 3的產量呈正相關性。研究表明添加鎂離子可以提高安絲菌素 P 3產量，為其它大環(huán)內酯類抗生素的發(fā)酵生產及大規(guī)模培 養(yǎng)提供了參考依據。
通過應用Plackett-Burman設計和折疊Plackett-Burman設計以及單因素實驗觀察到異丁醇和銨離子對安絲菌素 P 3的合成過程分別具有正效應和負效應。對相關的培養(yǎng)基進行條件優(yōu)化，觀察到銨離子的去除能提高它的產量，但銨離子作為常用氮源及含氮物質的中間代謝物，往往在發(fā)酵過程中積累。因此，結合抗生素的生物合成途徑并從蛋白質組學的角度研究其影響機制可為銨離子抑制的解除，后續(xù)培養(yǎng)基選擇及代謝途徑改造等提供重要信息。由此，對添加(37 mM)和不添加銨離子的發(fā)酵過程進行分析，結果表明銨離子抑制菌體生長速度，促進胞外異丁酸的代謝。從酶活性的檢測數據觀察到銨離子在整個發(fā)酵過程中提高纈氨酸代謝的第一個酶纈氨酸脫氫酶的活性，而不像其它抗生素發(fā)酵體系中報道的抑制作用。轉錄分析表明大部分產物生物合成基因的轉錄水平受銨離子抑制，與產量變化一致。進一步應用雙向電泳考察蛋白質組的響應，在pH3-5.6且PAGE濃度為13.5%的雙向電泳條件下獲得約1600個蛋白質點，質譜鑒定得到12個差異表達1.5倍以上的蛋白質，包括3-磷酸-甘油醛脫氫酶(下調2倍)，脂肪酸合成酶(上調1.7倍)，及負責絲氨酸生物合成的3-磷酸甘油酸脫氫酶(上調3.9倍)等。這些結果顯示銨離子影響脂肪酸和絲氨酸的生物合成，并調節(jié)安絲菌素 P 3生物合成基因的轉錄水平。至于異丁醇，實驗表明異丁醇促進安絲菌素 P 3生物合成前體CoA的供應，并影響氧化還原相關的基因和蛋白的表達水平。這些信息不但為安絲菌素 P 3發(fā)酵操作及其生物合成途徑的改造提供了有益信息，還可為其它大環(huán)內酯類抗生素的發(fā)酵提供借鑒[4]。參考文獻
[1]王石雷,何俊.安絲菌素P-3衍生物及其在制備治療胃癌藥物中的應用:CN202110829626.3[P].CN202110829626.3.
[2]朱曉媛.微生物發(fā)酵法制備安絲菌素P-3的研究[D].中南林業(yè)科技大學,2014.DOI:10.7666/d.Y2630573.
[3]賈永亮.鎂離子添加提高抗癌藥物安絲菌素P-3產量的研究[D].華東理工大學,2011.
[4]林錦霞.橙色珍貴束絲放線菌發(fā)酵生產抗癌藥物安絲菌素P-3的研究[J].華東理工大學, 2011.