背景^[1-3]

KYSE-410是一種人食管鱗癌細胞系，來源于一名51歲男子的頸段食管切除的低分化侵襲性食管鱗狀細胞癌（腫瘤侵入外膜明顯）。這種細胞系過表達hast-1（肝素結合生長因子）和cyclin D1。KYSE-410細胞系被廣泛用于食管癌的研究，包括發(fā)病機制、藥物篩選以及治療方法的研究。

由于KYSE-410細胞系是從一名男性患者的腫瘤中建立的，因此在生物醫(yī)學研究中，這種細胞系可以作為模擬人體食管癌的模型，有助于深入了解食管癌的生物學特性和發(fā)病機制。同時，KYSE-410細胞系也可以用于藥物篩選和細胞治療等研究，以評估新藥物或治療方法對食管癌的療效和潛在作用機制。

然而，需要注意的是，KYSE-410細胞系是從一名患者的腫瘤中建立的，因此可能存在一定的個體差異和遺傳背景差異。因此，在實驗結果解釋和應用時需要考慮這些因素，并進行充分的實驗驗證和臨床前研究。

KYSE-410(人食管鱗癌細胞)

KYSE-410(人食管鱗癌細胞)培養(yǎng)操作

1)復蘇KYSE-410(人食管鱗癌細胞)：以下細胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說明書為主。

將含有1 mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或將細胞懸液加入10 cm皿中，加入約8 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細胞密度。

2)KYSE-410(人食管鱗癌細胞)傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。

a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤所有細胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 min，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

c、按6-8 mL/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。

d、將細胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3)KYSE-410(人食管鱗癌細胞)凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存。下面T25瓶為例；

a、收集細胞及細胞培養(yǎng)液，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進行細胞計數(shù)。

b、根據(jù)細胞數(shù)量加入無血清細胞凍存液，使細胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細胞懸液，注意凍存管做好標識。

c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

應用^[4-5]

KYSE-410(人食管鱗癌細胞)可以用于TM4SF1通過與Integrinα6相互作用促進食管鱗癌轉移

①探討四跨膜蛋白超家族成員1(Transmembrane-4 L-six family member-1,TM4SF1)在食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)中的表達及臨床意義。②研究TM4SF1調控ESCC轉移的分子機制。

方法:首先利用生物信息學方法,通過TNM plot在線數(shù)據(jù)庫分析食管癌(esophageal cancer,EC)患者的腫瘤組織(tumor,T)及正常組織(normal,N)中TM4SF1基因的表達差異。收集35例ESCC患者的新鮮組織標本,采用蛋白質免疫印跡(western blot,WB)和實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)分析TM4SF1在蛋白和mRNA水平的表達差異。收集109對ESCC患者的組織石蠟標本,通過免疫組織化學染色(immunohistochemistry,IHC)檢測TM4SF1的表達,根據(jù)TM4SF1表達情況分為高表達組和低表達組,并分析其與ESCC患者臨床病理資料的相關性,多因素COX比例風險回歸模型分析ESCC患者預后不良的危險因素。其次,利用WB方法檢測人類食管上皮細胞(human esophageal epithelium cells,HEEC)和不同ESCC細胞系(TE-1,KYSE-510,KYSE-410(人食管鱗癌細胞)和Eca109)中TM4SF1的表達差異。

構建TM4SF1過表達、敲低以及敲低后再恢復表達的穩(wěn)轉細胞株。利用細胞粘附實驗檢測腫瘤細胞與不同細胞外基質(extracellular matrix,ECM)的粘附能力,Transwell實驗觀察層黏連蛋白(laminin)包被的不同食管癌細胞遷移能力。接下來,通過免疫共沉淀(immunoprecipitation,IP)檢測與TM4SF1存在相互作用的受體蛋白,WB檢測TM4SF1干擾表達后下游信號通路的變化,再次采用WB和Transwell實驗驗證TM4SF1-整合素(integrin)復合物影響的下游信號通路和細胞遷移功能。最后,利用IHC和Kaplan-Meier曲線檢測并分析TM4SF1、integrinα6和下游關鍵信號通路轉導分子表達情況及其與ESCC患者生存預后的關系。

結果:①TM4SF1在ESCC組織中的表達情況及其與臨床病理資料的關系:通過TNM plot在線數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)T組中TM4SF1基因表達水平明顯高于N組(P=1.42e-06)。在ESCC患者新鮮組織標本和石蠟標本中,T組TM4SF1的表達水平明顯高于N組(P<0.001),并與患者的臨床TNM分期(P=0.016)、淋巴結轉移(P=0.027)、分化程度(P=0.031)和腫瘤大小(P=0.023)明顯相關,并且TM4SF1高表達是ESCC患者預后不良的危險因素(P=0.006)。

②體外研究TM4SF1表達對ESCC細胞遷移能力的影響:首先WB檢測TM4SF1在HEEC和不同ESCC細胞系中表達,結果顯示內源性TM4SF1在Eca109細胞株中相對低表達,在KYSE410細胞株中相對高表達?；诖?我們成功構建了TM4SF1過表達的Eca109細胞(TM4SF1-Overexpression,TM4SF1-OE)、敲低表達的KYSE-410(人食管鱗癌細胞)細胞(TM4SF1-sh#1,TM4SF1-sh#2)及敲低后再恢復TM4SF1表達的KYSE-410(人食管鱗癌細胞)細胞(TM4SF1-Rescue,TM4SF1-Res)。細胞粘附實驗發(fā)現(xiàn):Laminin介導的細胞粘附能力在TM4SF1-OE細胞中明顯增強。Transwell實驗結果顯示:在laminin包被條件下,與對照組(contro1con)細胞相比,TM4SF1-OE組細胞的遷移能力明顯增強(P<0.001),TM4SF1-sh組細胞的遷移能力明顯降低(P<0.01),并且這種抑制作用伴隨TM4SF1表達的恢復而逆轉(P<0.01)。

參考文獻

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