背景[1-3]
PC-3M-2B4是一種細胞系，通常用于科學研究和實驗室環(huán)境中的細胞培養(yǎng)。這種細胞系經(jīng)過優(yōu)化，可以在特定的培養(yǎng)基中保持最佳的生長狀態(tài)。
PC-3M-2B4細胞專用培養(yǎng)基是一種液體形態(tài)的培養(yǎng)基，其中包含了PC-3M-2B4細胞生長所需的各種成分。這種培養(yǎng)基的儲存條件為2℃-8℃，需要避光儲存，并且有效期為3個月。在使用這種培養(yǎng)基時，應(yīng)遵循特定的操作步驟，如加入細胞、定期更換培養(yǎng)基等，以確保細胞的正常生長和繁殖。
此外，PC-3M-2B4細胞也可以用于細胞分裂中期染色體制備等實驗。這種實驗需要特定的試劑和操作步驟，如加入秋水仙素、離心收集細胞、固定和染色等，以獲得高質(zhì)量的染色體樣本。
PC-3M-2B4
PC-3M-2B4細胞系培養(yǎng)操作
1)復蘇PC-3M-2B4細胞系：以下細胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說明書為主。
將含有1 mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓毎麘乙杭尤?0 cm皿中，加入約8 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細胞密度。
2)PC-3M-2B4細胞系傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。
a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。
b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤所有細胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 min，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
c、按6-8 mL/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。
d、將細胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
3)PC-3M-2B4細胞系凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存。下面T25瓶為例；
a、收集細胞及細胞培養(yǎng)液，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進行細胞計數(shù)。
b、根據(jù)細胞數(shù)量加入無血清細胞凍存液，使細胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細胞懸液，注意凍存管做好標識。
c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
應(yīng)用[4-5]
PC-3M-2B4可以用于LASS2/TMSG-1基因沉默對人前列腺癌細胞生物學功能的影響及其機制
探討LASS2/TMSG-1基因沉默對PC-3M-2B4細胞增殖、遷移及侵襲的影響及其作用機制。
方法將實驗分為3組:空白對照組(僅轉(zhuǎn)染PBS的PC-3M-2B4細胞)、無關(guān)陰性對照siRNA組及LASS2/TMSG-1 siRNA轉(zhuǎn)染組。首先針對LASS2/TMSG-1基因,設(shè)計并合成siRNA;在脂質(zhì)體介導下瞬時轉(zhuǎn)染人前列腺癌PC-3M-2B4細胞24 h后分別采用Western blot和RT-PCR技術(shù)檢測細胞內(nèi)LASS2/TMSG-1蛋白及ATP6L mRNA表達水平;使用BCECF AM H+敏感熒光探針檢測轉(zhuǎn)染24、36、48、96 h后3組細胞的細胞內(nèi)H+濃度;用MTT法檢測細胞增殖;劃痕修復實驗和Transwell體外侵襲實驗分別檢測PC-3M-2B4細胞的遷移和侵襲能力。
結(jié)果轉(zhuǎn)染LASS2/TMSG-1 siRNA 24 h后,LASS2/TMSG-1 siRNA組LASS2/TMSG-1蛋白表達與對照組相比下降65%,ATP6L mRNA表達水平與對照組比較提高75%。通過BCECF AM熒光探針檢測LASS2/TMSG-1 siRNA轉(zhuǎn)染組細胞內(nèi)H+濃度明顯下降,且與空白對照組及無關(guān)陰性對照siRNA組相比,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。MTT法檢測顯示,PC-3M-2B4細胞在轉(zhuǎn)染24、48 h后,3組細胞生長速度無明顯差異(P>0.05);轉(zhuǎn)染72 h后LASS2/TMSG-1 siRNA轉(zhuǎn)染組細胞生長速度明顯升高,與空白對照組、無關(guān)陰性對照siRNA組比較,差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。劃痕修復試驗和Transwell體外侵襲實驗顯示,轉(zhuǎn)染LASS2/TMSG-1 siRNA 24 h后,與空白對照組及無關(guān)陰性對照siRNA組相比,能顯著促進細胞遷移和侵襲能力(P<0.05)。
結(jié)論體外合成的siRNA能有效沉默LASS2/TMSG-1基因表達,同時上調(diào)V-ATPase質(zhì)子泵中關(guān)鍵性亞基—ATP6L mRNA的表達水平,且基因沉默后其細胞內(nèi)H+濃度下降,提示LASS2/TMSG-1基因可能與ATP6L相互作用、共同參與對細胞內(nèi)pH值的影響,導致腫瘤細胞內(nèi)外微環(huán)境的改變并影響腫瘤細胞的生物學行為,如增殖、遷移及侵襲能力。
參考文獻
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