背景^[1-3]

CNE-2Z是一種人鼻咽癌細(xì)胞系，來(lái)源于一名患有鼻咽癌的患者的腫瘤組織。這種細(xì)胞系經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)和傳代，保持了遺傳穩(wěn)定性，并被廣泛用于生物醫(yī)學(xué)研究中，特別是在鼻咽癌的發(fā)病機(jī)制、藥物篩選和基因治療等領(lǐng)域。

CNE-2Z細(xì)胞系具有一些特定的生物學(xué)特性，如增殖速度快、易于培養(yǎng)和具有特定的基因表達(dá)模式。此外，CNE-2Z細(xì)胞系還可以用于制備細(xì)胞復(fù)蘇產(chǎn)品，如CNE-2Z人鼻咽癌復(fù)蘇細(xì)胞，并附有STR鑒定報(bào)告，以確保細(xì)胞的身份和遺傳穩(wěn)定性。

在研究中，CNE-2Z細(xì)胞系常被用來(lái)模擬鼻咽癌的生長(zhǎng)和侵襲行為，以及研究鼻咽癌發(fā)生和發(fā)展的分子機(jī)制。此外，CNE-2Z細(xì)胞系也常被用作藥物篩選的模型，以評(píng)估潛在抗癌藥物對(duì)鼻咽癌細(xì)胞的殺傷作用。

然而，需要注意的是，雖然CNE-2Z細(xì)胞系具有一定的代表性，但并不能完全模擬真實(shí)的人體環(huán)境。因此，在將實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)用于臨床之前，還需要進(jìn)行更多的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證和臨床研究。

CNE-2Z

CNE-2Z細(xì)胞系培養(yǎng)操作

1)復(fù)蘇CNE-2Z細(xì)胞系：以下細(xì)胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)為主。

將含有1 mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10 cm皿中，加入約8 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過(guò)夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2)CNE-2Z細(xì)胞系傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤(rùn)所有細(xì)胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

c、按6-8 mL/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無(wú)菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。

d、將細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3)CNE-2Z細(xì)胞系凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。下面T25瓶為例；

a、收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，裝入無(wú)菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

b、根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入無(wú)血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識(shí)。

c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

應(yīng)用^[4-5]

CNE-2Z可以用于沉默ATF5對(duì)鼻咽癌細(xì)胞凋亡及周期的影響

比較轉(zhuǎn)錄激活因子5(Activating transcription factor 5,ATF5)沉默前后鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期進(jìn)程的變化,探討ATF5沉默對(duì)鼻咽癌細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期影響的可能機(jī)制,為提高鼻咽癌治療效果提供新思路。

方法:1)以鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞為研究對(duì)象,運(yùn)用sh RNA-ATF5慢病毒載體感染CNE-2Z細(xì)胞(sh RNA-ATF5組),以慢病毒空載體感染CNE-2Z細(xì)胞(LV-sh RNANC)作為陰性對(duì)照組(NC組),未感染慢病毒CNE-2Z細(xì)胞作空白對(duì)照組(Control組)。

2) 利用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction,q RT-PCR)及蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)CNE-2Z細(xì)胞慢病毒干擾效率。

3) 采用流式細(xì)胞儀(Fluorescence Activated Cell Sorter,FACS)Annexin VAPC單染法及Tunel免疫熒光檢測(cè)ATF5沉默前后CNE-2Z細(xì)胞凋亡率的變化,運(yùn)用碘化丙啶(Propidumiodide,PI)法流式細(xì)胞儀檢測(cè)ATF5沉默前后CNE-2Z細(xì)胞周期進(jìn)程的變化。

4) Western blot檢測(cè)ATF5沉默及過(guò)表達(dá)對(duì)CNE-2Z細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax,以及周期蛋白細(xì)胞周期素D1(Cyclin D1)、細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)激酶4(Cyclin Dependent Kinase 4,CDK4)、細(xì)胞分裂控制蛋白激酶2(Cell division control protein kinase 2,Cdc2)和細(xì)胞周期素B1(Cyclin B1)表達(dá)水平的影響。

結(jié)果:(1)q RT-PCR和Western blot檢測(cè)結(jié)果均顯示,sh RNA-ATF5慢病毒載體能顯著抑制鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞ATF5的表達(dá)(P<0.01),干擾效率可達(dá)81.7%。

(2) 流式細(xì)胞儀分析顯示,Control組、NC組及sh RNA-ATF5組CNE-2Z細(xì)胞凋亡率分別為3.61%±0.10,3.80%±0.18,6.26%±0.15,sh RNA-ATF5能顯著增加CNE-2Z細(xì)胞凋亡率(P<0.01);Tunel實(shí)驗(yàn)也顯示,sh RNA-ATF5組較Control組及NC組CNE-2Z細(xì)胞的染色強(qiáng)度顯著增加。

(3) PI-FACS分析結(jié)果顯示,sh RNA-ATF5組CNE-2Z細(xì)胞G1期的細(xì)胞數(shù)顯著減少(P<0.01),而S期和G2/M期的細(xì)胞數(shù)均增多(P<0.05,P<0.01),以G2/M期為著。

(4) Western blot檢測(cè)表明,sh RNA-ATF5組CNE-2Z細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)水平較Control組、NC組顯著降低(P<0.01),而B(niǎo)ax蛋白表達(dá)水平卻明顯增加(P<0.01);且G1/S期調(diào)控蛋白Cyclin D1、CDK4及G2/M期調(diào)控蛋白Cdc2、Cyclin B1的表達(dá)水平顯著減低(P均<0.01)。

(5) Western Blot結(jié)果顯示,ATF5過(guò)表達(dá)的CNE-2Z細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著增加(P<0.01),而B(niǎo)ax蛋白表達(dá)水平卻明顯降低(P<0.01);且G1/S期調(diào)控蛋白Cyclin D1、CDK4及G2/M期調(diào)控蛋白Cdc2、Cyclin B1的表達(dá)水平均顯著增加(P均<0.05)。

結(jié)論:(1)ATF5沉默能促進(jìn)鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞凋亡,其可能部分與增加Bax蛋白表達(dá)水平及降低Bcl-2蛋白表達(dá)水平有關(guān);(2)ATF5沉默能阻滯CNE-2Z細(xì)胞于G2/M期,其可能部分源于Cyclin D1/CDK4及Cdc2/Cyclin B1蛋白表達(dá)的下調(diào)。

參考文獻(xiàn)

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