概述^[1]

gRNA文庫(kù)的建立將為重要基因功能的篩選、疾病機(jī)制研究及藥物研發(fā)等方面提供新的動(dòng)力，大大加快人類功能基因組研究計(jì)劃的進(jìn)展。

構(gòu)建方法^[1]

CRISPR-Cas9系統(tǒng)是一種強(qiáng)大的基因組編輯工具，如風(fēng)暴一般席卷了整個(gè)基因組工程領(lǐng)域。最近Andrea Ventura等人報(bào)道了這一系統(tǒng)在gRNA 文庫(kù)構(gòu)建方面的應(yīng)用，而這樣的應(yīng)用往往需要同時(shí)表達(dá)一對(duì)gRNA，比如用Cas9切口酶進(jìn)行大片段刪除。CRISPR-Cas9是細(xì)菌在漫長(zhǎng)的進(jìn)化過(guò)程中演化出的重要防御機(jī)制。這個(gè)監(jiān)控體系能夠根據(jù)引導(dǎo)RNA（gRNA）的指示，靶標(biāo)并降解入侵者的遺傳物質(zhì)。

現(xiàn)在，CRISPR-Cas9已經(jīng)成為了炙手可熱的基因組編輯工具，幫助世界各地的研究者們解決實(shí)際問(wèn)題。近年來(lái)，這一技術(shù)在多個(gè)領(lǐng)域中展現(xiàn)了自己強(qiáng)大的實(shí)力，催生了大量的重要成果。人們發(fā)現(xiàn)，同時(shí)表達(dá)內(nèi)切酶Cas9與gRNA，可以誘導(dǎo)真核細(xì)胞發(fā)生雙鏈DNA斷裂。在真核生物中，雙鏈DNA斷裂主要通過(guò)容易出錯(cuò)的非同源末端連接進(jìn)行修復(fù)，會(huì)在目標(biāo)位點(diǎn)形成小indel（插入缺失）。因此，CRISPR-Cas9系統(tǒng)是破壞基因編碼框的一種簡(jiǎn)單途徑。研究表明，CRIPSR-Cas9可以高效靶標(biāo)多個(gè)基因，實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的功能缺失篩選。

研究人員開(kāi)發(fā)了一個(gè)快速制備配對(duì)gRNA文庫(kù)的有效方法，大大拓展了CRIPSR在功能篩選方面的應(yīng)用。該方法可以將寡核苷酸池中的一對(duì)gRNA克隆到任意CRISPR 表達(dá)載體上，還可以確保兩個(gè)gRNA使用獨(dú)立的啟動(dòng)子。研究顯示，一個(gè)慢病毒載體上的兩個(gè)gRNA不適合使用相同的啟動(dòng)子。研究人員為此構(gòu)建了新型慢病毒載體，搭載一個(gè)人類U6啟動(dòng)子和一個(gè)經(jīng)過(guò)改良的鼠類U6啟動(dòng)子。這項(xiàng)研究為人們提供了一個(gè)簡(jiǎn)單、快速又便宜的配對(duì)gRNA文庫(kù)制備法，大大拓展了CRISPR技術(shù)在功能基因組學(xué)研究中的應(yīng)用前景。

主要參考資料

[1] Rapid and efficient one-step generation of paired gRNA CRISPR-Cas9 libraries