背景及概述^[1]

T4RNALigase是以不依賴于模板的形式催化供體核酸的5'-磷?；┒撕褪荏w核酸的3'-羥基末端形成磷酸二酯鍵。該酶活性依賴ATP，可作用于廣泛的底物，包括RNA，DNA，寡核糖核酸、寡脫氧核糖核酸和很多其它核酸衍生物。T4RNALigase2主要用于RNA5´末端加寡聚核酸用于映射和測(cè)序5´端，或用于cDNA合成(RACE)；用于3'-末端RNA標(biāo)記；用于連接RNA和DNA；用于修飾或突變RNA。有研究為T3DNA連接酶和T4RNALigase2提供一種在RNA上m6A百分比含量的定量分析中的新應(yīng)用，首次發(fā)現(xiàn)T3DNA連接酶和T4RNALIGASE2對(duì)m6A敏感，與A相比，m6A可以抑制T3DNA連接酶和T4RNALIGASE2的連接活性，基于該特性，以RNA(含的A的RNA和含有m6A的RNA)為模板，建立了基于連接-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)定量測(cè)定m6A百分比含量的方法。

該方法首先確定RNA上的待測(cè)位點(diǎn)(待測(cè)位點(diǎn)是腺嘌呤，可能含有部分N6甲基腺嘌呤，當(dāng)待測(cè)位點(diǎn)是m6A時(shí)，連接酶T3DNA連接酶或T4RNALIGASE2的連接活性被抑制，左探針和右探針不會(huì)被連接；當(dāng)待測(cè)位點(diǎn)是A時(shí)，連接酶會(huì)將左探針和右探針連接起來)，用相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線定量該待測(cè)位點(diǎn)A的含量，其次在該RNA的待測(cè)位點(diǎn)附近選擇一個(gè)不含m6A的A位點(diǎn)作為參比位點(diǎn)，用相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線定量該參比位點(diǎn)A的含量，然后用參比為點(diǎn)A的含量減去待測(cè)位點(diǎn)A的含量得到待測(cè)位點(diǎn)m6A的含量，用待測(cè)位點(diǎn)m6A的含量除以待測(cè)位點(diǎn)A和m6A的總和，即可得到該待測(cè)位點(diǎn)m6A的百分比含量。

主要參考資料

[1] CN201611020857.5 T3DNA連接酶和T4RNA連接酶2在檢測(cè)N⁶甲基腺嘌呤中的應(yīng)用