背景[1-7]
SANT-1(Hedgehog/Smoothened拮抗劑)是Smoothened(Smo)受體特異性抑制劑。SANT-1直接結(jié)合到Smoothened(Smo)受體，Kd為1.2 nM，且抑制smo激動劑作用效果，IC50為20 nM。SANT-1比其他拮抗劑更大程度地降低SAG對Shh-LIGHT2細(xì)胞的刺激。SANT-1同等有效抑制野生型和致癌的Smo。SANT-1作用于Shh-LIGHT2細(xì)胞，抵消SAG-誘導(dǎo)通路激活SANT-1能夠抑制BODIPY-Cyclopamine結(jié)合到表達(dá)Smo的細(xì)胞，但SANT-1不能完全抑制這種關(guān)聯(lián)性。
這說明它們與Smo之間的相互作用，可能會改變其對Cyclopamine的親和力，而不是直接競爭性結(jié)合Cyclopamine。SANT-1作用于SmoA1-LIGHT2細(xì)胞，抑制通路激活，在Shh-LIGHT2實驗中，也可觀察到相似的作用效力。SANT-1在Shh-LIGHT2和BODIPY-Cyclopamine實驗中，具有不同的抑制活性，且異常有效抑制SAG調(diào)節(jié)的通路激活。
SANT-1有效抑制Cyclopamine和Jervine誘導(dǎo)的Smo易位到初級纖毛上。SANT-1抑制PKA刺激的Smo運輸?shù)浇死w毛。當(dāng)與HDAC抑制劑SAHA聯(lián)用時，SANT-1能夠抑制細(xì)胞增殖，且抑制抗Gemcitabine的胰腺癌細(xì)胞系Panc-1和BxPC-3的菌落形成。Smoothened是一種人類蛋白質(zhì)，由SMO基因編碼。Smoothened是一類Frizzled（F類）G蛋白偶聯(lián)受體，是hedgehog信號通路的一個組成部分，從蒼蠅到人類是保守的。
它是天然致畸劑環(huán)巴胺的分子靶標(biāo)。細(xì)胞定位在SMO的功能中起重要作用，SMO作為7次跨膜蛋白錨定于細(xì)胞膜。通過聲波刺猬配體刺激修補(bǔ)的12次跨膜受體導(dǎo)致SMO轉(zhuǎn)移至脊椎動物中的初級纖毛，其過程涉及從初級纖毛中修補(bǔ)，其通常定位于其未刺激狀態(tài)。在睫狀體定位所需的結(jié)構(gòu)域中發(fā)生突變的脊椎動物SMO通常不能促進(jìn)hedgehog通路的激活。相反，SMO可以組成性地定位于初級纖毛，并且可能由于前述結(jié)構(gòu)域中的色氨酸至亮氨酸突變而組成性地激活途徑信號傳導(dǎo)。
SMO已經(jīng)示出通過沿膜的橫向運送路徑從所述主纖毛的纖毛膜本身附近質(zhì)膜修補(bǔ)的刺激過程中移動，如通過囊泡通過定向轉(zhuǎn)運反對。已知cAMP-PKA途徑通常促進(jìn)SMO的橫向移動和刺猬蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。在像果蠅這樣的無脊椎動物中，SMO不會在纖毛上組織，而是在刺猬結(jié)合到修補(bǔ)后通常易位到質(zhì)膜。細(xì)胞定位后，SMO必須另外通過不同的機(jī)制激活，以刺激hedgehog信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，但該機(jī)制尚不清楚。
有證據(jù)表明存在一種未鑒定的內(nèi)源性配體，它可以結(jié)合SMO并激活它。據(jù)信SMO中的突變可以模擬配體誘導(dǎo)的SMO構(gòu)象并激活組成型信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。SMO可以作為致癌基因發(fā)揮作用。激活SMO突變可導(dǎo)致hedgehog途徑的不受調(diào)節(jié)的激活，并且可用作癌癥的驅(qū)動突變，例如成神經(jīng)管細(xì)胞瘤，基底細(xì)胞癌，胰腺癌和前列腺癌。
因此，SMO是一種有吸引力的抗癌藥物靶標(biāo)，以及已知直接靶向SMO的許多hedgehog通路激動劑和拮抗劑。已知膽固醇在調(diào)節(jié)總體hedgehog途徑中是至關(guān)重要的，并且膽固醇合成途徑中的先天性突變可以特異性地使SMO失活，導(dǎo)致發(fā)育障礙。例如，氧甾醇20（S）-OHC已知通過結(jié)合附近的其細(xì)胞外氨基末端區(qū)中的富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域激活脊椎動物SMO。在癌癥的情況下，20（S）-OHC是所提出的抗癌氧固醇結(jié)合抑制劑的靶標(biāo)。
應(yīng)用[7][8]
SANT-1(Hedgehog/Smoothened拮抗劑)可用于誘導(dǎo)細(xì)胞死亡：
利用SANT-1誘導(dǎo)細(xì)胞死亡構(gòu)建了SANT1突變體SANT1-S1和SANT1-S2,它們基本序列完全一致,具有相同蛋白翻譯潛能,但只有SANT1-S1與SANT1高級結(jié)構(gòu)類似。在腎癌細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染表達(dá)質(zhì)粒之后,只有SANT1和SANT1-S1保持了誘導(dǎo)基因表達(dá)的功能,說明SANT1的功能基礎(chǔ)是其作為蛋白結(jié)合骨架的高級結(jié)構(gòu)。通過軟件預(yù)測,我們發(fā)現(xiàn)SANT1和SANT1-S1同SFPQ蛋白具有高結(jié)合能力,而SANT1-S2的結(jié)合力則被顯著削弱。
通過CLIP實驗,證明了SANT1與SFPQ的直接結(jié)合,同時在SANT1高表達(dá)的癌旁組織和769-P細(xì)胞中,啟動子區(qū)SFPQ的結(jié)合顯著降低,說明SFPQ在SLC47A2啟動子區(qū)參與形成轉(zhuǎn)錄抑制型蛋白復(fù)合物。據(jù)文獻(xiàn)報道,SFPQ可以與HDAC1形成蛋白復(fù)合物,通過抑制啟動子區(qū)H3K27ac的修飾水平而抑制基因表達(dá)。
由于HDAC1與E2F1形成的復(fù)合物同c-Myc/E2F1/miR-20a環(huán)路對SLC47A2的表達(dá)調(diào)節(jié)密切相關(guān),因此推測SFPQ與E2F1/HDAC1可以形成復(fù)合物,共同參與基因表達(dá)調(diào)節(jié)。Co-IP實驗驗證了769-P細(xì)胞系中SFPQ/E2F1/HDAC1的存在,結(jié)構(gòu)完整的SANT1可以與靶向于SLC47A2的SFPQ/E2F1/HDAC1復(fù)合物形成RNA-蛋白復(fù)合體,介導(dǎo)E2F1/HDAC1的脫靶。SANT1高表達(dá)引起的E2F1/HDAC1的脫靶引起啟動子區(qū)H3K27ac修飾水平和S-5-PRNAPII結(jié)合的顯著上調(diào),激活了基因的轉(zhuǎn)錄水平。
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