背景^[1-3]

大鼠鈣調(diào)素(CAM)Elisa試劑盒是用于定量檢測(cè)大鼠樣本中鈣調(diào)素（CaM）水平的實(shí)驗(yàn)工具。該試劑盒基于酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）的原理，通過(guò)特異性抗體與樣本中的CaM結(jié)合，形成抗原-抗體復(fù)合物，進(jìn)而通過(guò)酶標(biāo)記的二抗和底物反應(yīng)，產(chǎn)生可測(cè)量的信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)CaM水平的定量檢測(cè)。

實(shí)驗(yàn)原理：該試劑盒采用雙抗體夾心法測(cè)定標(biāo)本中大鼠鈣調(diào)素(CAM)水平。通過(guò)純化的大鼠鈣調(diào)素(CAM)抗體包被微孔板制成固相抗體，加入待測(cè)樣本中的大鼠鈣調(diào)素(CAM)，再與HRP（辣根過(guò)氧化物酶）標(biāo)記的大鼠鈣調(diào)素(CAM)抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物。經(jīng)過(guò)洗滌后，加入底物TMB進(jìn)行顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺與樣品中的大鼠鈣調(diào)素(CAM)濃度呈正相關(guān)。最后，使用酶標(biāo)儀在特定波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值），并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中大鼠鈣調(diào)素(CAM)的濃度。

大鼠鈣調(diào)素(CAM)Elisa試劑盒

大鼠鈣調(diào)素(CAM)Elisa試劑盒操作步驟：

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，各試劑均應(yīng)平衡至室溫（試劑不能直接在37℃溶解）；試劑或樣品稀釋時(shí)，均需混勻，混勻時(shí)盡量避免起泡。實(shí)驗(yàn)前應(yīng)預(yù)測(cè)樣品含量，如樣品濃度過(guò)高時(shí)，應(yīng)對(duì)樣品進(jìn)行稀釋?zhuān)允瓜♂尯蟮臉悠贩显噭┖械臋z測(cè)范圍，計(jì)算時(shí)再乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。

1.加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?00μl，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品100μl，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，37℃反應(yīng)120分鐘。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性，每次實(shí)驗(yàn)請(qǐng)使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加檢測(cè)溶液A工作液100μl（在使用前一小時(shí)內(nèi)配制），酶標(biāo)板加上覆膜,37℃反應(yīng)60分鐘。

3.溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，大約400μl/每孔，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）。

4.每孔加檢測(cè)溶液B工作液（同檢測(cè)A工作液）100μl，酶標(biāo)板加上覆膜37℃反應(yīng)60分鐘。

5.溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，350μl/每孔，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）。

6.依序每孔加底物溶液90μl，酶標(biāo)板加上覆膜37℃避光顯色（30分鐘內(nèi)，此時(shí)肉眼可見(jiàn)標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色，后3-4孔梯度不明顯，即可終止）。

7.依序每孔加終止溶液50μl，終止反應(yīng)，此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，底物反應(yīng)時(shí)間到后應(yīng)盡快加入終止液。

8.用酶聯(lián)儀在450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的光密度（OD值）。在加終止液后立即進(jìn)行檢測(cè)。

大鼠鈣調(diào)素(CAM)Elisa試劑盒結(jié)果影響因素：影響ELISA結(jié)果測(cè)定的因素主要包括標(biāo)本因素、試劑因素和操作因素。例如，標(biāo)本的采集、保存和處理方式可能會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果；試劑的質(zhì)量和穩(wěn)定性也會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性；操作過(guò)程中的溫度、時(shí)間、洗滌次數(shù)等因素也可能對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。

大鼠鈣調(diào)素(CAM)Elisa試劑盒注意事項(xiàng)：在使用大鼠鈣調(diào)素(CAM)ELISA試劑盒時(shí)，需要注意以下幾點(diǎn)：首先，確保實(shí)驗(yàn)環(huán)境干凈、整潔，避免污染；其次，按照說(shuō)明書(shū)的要求進(jìn)行加樣和操作；第三，嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的溫度和時(shí)間；第四，及時(shí)記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)并進(jìn)行分析；最后，注意實(shí)驗(yàn)結(jié)果的解讀和判斷。

應(yīng)用^[4][5]

大鼠鈣調(diào)素(CAM)Elisa試劑盒可以用于小半夏湯對(duì)化療性異食癖模型大鼠5-HT3R/CaM/CaMKⅡ/ERK1/2信號(hào)通路的影響

觀察小半夏湯對(duì)順鉑、1-PBG致大鼠異食癖防治作用的基礎(chǔ)上,以5-HT3R后第二信使作為切入點(diǎn),探討小半夏湯防治CINV的作用機(jī)制。

方法:1.制備小半夏湯凍干粉并用高效液相色譜法(High performance liquid chromatography,HPLC)對(duì)小半夏湯凍干粉的有效成分進(jìn)行質(zhì)量控制研究。2.將Wistar雄性大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、順鉑模型組、順鉑-昂丹司瓊治療組、順鉑-小半夏湯治療組4組。腹腔注射6 mg/kg順鉑建立化療性大鼠異食癖惡心嘔吐模型,每24 h稱(chēng)量并記錄各組大鼠攝食高嶺土量、攝食飼料量和體質(zhì)量。免疫熒光技術(shù)和大鼠鈣調(diào)素(CAM)Elisa試劑盒檢測(cè)CaM和5-HT3R在小腸和腦的表達(dá)及共定位作用;Western Blot技術(shù)檢測(cè)CaMKⅡ、pCaMKⅡ、ERK1/2、pERK1/2在小腸和腦的表達(dá)水平。

3. 將Wistar雄性大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、1-PBG模型組、1-PBG-昂丹司瓊治療組、1-PBG-小半夏湯治療組4組。腹腔注射25 mg/kg 1-PBG建立大鼠異食癖惡心嘔吐模型,每24 h稱(chēng)量并記錄各組大鼠攝食高嶺土量、攝食飼料量和體質(zhì)量。免疫熒光檢測(cè)CaM和5-HT3R在小腸和腦的表達(dá)及共定位作用;Western Blot方法和大鼠鈣調(diào)素(CAM)Elisa試劑盒檢測(cè)CaMKⅡ、p CaMKⅡ、ERK1/2、pERK1/2在小腸和腦的表達(dá)水平。

大鼠鈣調(diào)素(CAM)Elisa試劑盒結(jié)果:1.小半夏湯凍干粉樣品中6-姜酚的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積結(jié)果為(15.285,4.3475);6-姜烯酚的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)保留面積結(jié)果為(0.376,0.0984);麻黃堿的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積結(jié)果為(17.097,43.9961);琥珀酸的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積結(jié)果為(7.025,3.0048)。2.與正常對(duì)照組比較,順鉑模型組大鼠在造模后24 h和72 h攝食高嶺土量均顯著增加(P<0.05),說(shuō)明大鼠異食癖模型造模成功;順鉑模型組大鼠小腸和腦組織中5-HT3R和CaM蛋白表達(dá)明顯升高,共定位作用增強(qiáng);順鉑模型組小腸和腦組織中CaMKⅡ、pCaMKⅡ、ERK1/2和pERK1/2蛋白表達(dá)增加(P<0.05)。

參考文獻(xiàn)

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