背景及概述
HEp-2/人喉表皮樣癌細胞的類型：貼壁；形態(tài)：CM1-1培養(yǎng)液中，貼壁，上皮細胞樣，多角形，梭形，成塊生長。傳代方法：將舊培養(yǎng)液吸除，PBS清洗兩遍后，加入6mL（/100mm皿）胰酶，在顯微鏡下觀察，期間禁止搖晃培養(yǎng)皿，細胞剛有脫落時，則吸除大部分胰酶，留約0.5mL，移至培養(yǎng)箱消化，約2min取出。傳代用12mL CM1-1培養(yǎng)液終止消化，輕輕吹打均勻細胞，后可分3~6皿培養(yǎng)；生長條件：37℃，5%CO2，CM1-1培養(yǎng)液。CM1-1培養(yǎng)液：90%DMEM-H+10%FBS。DMEM-H：DMEM高糖培養(yǎng)液，含谷氨酰胺，含丙酮酸鈉。存儲條件：凍存則用6mL凍存液（90%FBS+10%DMSO）終止消化，吹打均勻，分為6支凍存管，用程序降溫盒于-80℃凍存，過夜轉移至液氮中保存。
相關研究[1-3]
賈建平等人探討了ECRG4對人喉鱗癌細胞Hep-2侵襲轉移能力的影響及機制。方法:設計并構建ECRG4過表達載體、并轉染Hep-2細胞，Real-time PCR及Western Blot檢測Hep-2細胞中ECRG4 mRNA和蛋白的表達;通過細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力，Transwell實驗檢測細胞遷移和侵襲能力，應用Western Blot檢測NF-κB信號通路相關蛋白NF-κB p65在胞漿和胞核中的表達及轉錄因子Snail、EMT標志性分子E-cadherin，N-cadherin、Vinmentin蛋白表達。
結果:在Hep-2細胞中過表達ECRG4后，ECRG4 mRNA與蛋白表達水平顯著升高，劃痕和Tranwell實驗表明過表達ECRG4可抑制細胞的遷移和侵襲;同時過表達ECRG4可下調細胞核中NF-κB p65蛋白表達，上調細胞漿中NF-κB p65蛋白表達;過表達ECRG4可上調EMT上皮標志物E-cadherin蛋白，下調轉錄因子Snail及EMT間質標記物Vimentin和N-cadherin蛋白表達。結論:ECRG4可能通過抑制NF-κB/Snail信號通路來抑制EMT的發(fā)生，進而抑制Hep-2細胞的侵襲轉移。
趙越等人探討了miR-362-3p在喉癌組織中的表達水平及其對喉癌Hep-2細胞遷移能力的影響。方法：收集50例喉癌組織及對應癌旁組織標本，實時PCR方法檢測miR-362-3p在喉癌組織和癌旁組織中表達水平，分析miR-362-3p的表達與喉癌患者臨床病理特征的關系;將miR-362-3p模擬物、抑制劑以及陰性對照miRNA分別轉染喉癌Hep-2細胞，實時PCR檢測轉染效率;劃痕和Transwell實驗檢測miR-362-3p對喉癌Hep-2細胞遷移能力的影響。結果 miR-362-3p在喉癌組織中表達水平顯著高于癌旁組織(P <0.05)，且與喉癌患者淋巴結轉移及臨床分期有關;上調miR-362-3p表達水平能促進喉癌Hep-2細胞的遷移能力，下調miR-362-3p表達水平能抑制喉癌Hep-2細胞的遷移能力(均P <0.05)。結論 miR-362-3p在喉癌組織中表達上調，且能夠促進喉癌細胞的遷移能力，提示其發(fā)揮潛在癌基因作用。
唐甜等人探究了抑制SHIP2對喉癌Hep-2細胞增殖、凋亡和侵襲、遷移的影響;探究X射線處理喉癌Hep-2細胞后細胞增殖、凋亡和周期的變化及SHIP2的表達情況;探究靶向抑制SHIP2基因聯(lián)合放射治療對喉癌Hep-2細胞增殖、凋亡和周期的影響及對放療增敏的可能機制。
方法:(1)應用小分子干擾RNA技術抑制喉癌Hep-2細胞SHIP2的表達，實驗分為5組:空白對照組(Control)、陰性對照組(Negative)、干擾組1(siRNA1)、干擾組2(siRNA2)、干擾組3(siRNA3)]，RT-qPCR、Western Blot檢測轉染24 h后干擾效果;
(2)取對數(shù)生長期的喉癌Hep-2細胞，分別給予0，4 Gy X射線(SSD=100 cm)處理，CCK-8檢測細胞增殖活力，AnnexinPI-FITC/PI雙染檢測細胞凋亡，PI單染檢測細胞周期，RT-qPCR、Western Blot檢測SHIP2 mRNA和蛋白的相對表達量;
(3)取對數(shù)生長期的喉癌Hep-2細胞，實驗分4組(空白對照組Control、單純放射組4 Gy、干擾組siRNA-SHIP2、聯(lián)合處理組siRNASHIP2+4 Gy)。Western Blot檢測SHIP2、pSHIP2、pAKT、caspase-3、P21和P27蛋白的相對表達量。
結果:(1)轉染24 h后干擾組2 siRNA2下調作用最顯著，較空白對照組SHIP2 mRNA下調達60. 1%(P<0. 05)、SHIP2蛋白下調達57. 8%(P<0. 05);與空白對照組對比，siRNA2抑制SHIP2表達后喉癌Hep-2細胞增殖活力、侵襲和遷移能力降低，凋亡增加(P<0. 05)。
(2)與0 Gy組比較，放射組各組細胞增殖活力降低，凋亡和G2期阻滯增加(P<0. 05);4Gy射線處理后SHIP2 mRNA、SHIP2和pSHIP2蛋白的相對表達量較空白對照組降低(P<0. 05)。
(3)與空白對照組、siRNA-SHIP2組和4 Gy組比較，聯(lián)合處理組細胞增殖活力降低，凋亡和G2期阻滯增加(P<0. 05)，SHIP2和pSHIP2、pAKT的相對表達量降低(P<0. 05)，caspase-3、P21和P27蛋白的相對表達量升高(P<0. 05)。
結論:靶向抑制SHIP2可與放射治療協(xié)同抑制喉鱗癌Hep-2細胞的增殖活力，促進細胞凋亡和細胞周期G2期阻滯，從而發(fā)揮放射增敏的作用。其可能機制是靶向抑制SHIP2表達通過下調PI3K/Akt信號通路活性，進而解除對下游促凋亡因子caspase3和周期阻滯因子P21和P27的抑制作用，與放射線協(xié)同增強對喉癌Hep-2細胞的殺傷作用，從而發(fā)揮放療增敏作用。
主要參考資料
[1] 賈建平，孫曉慧.ECRG4對人喉鱗癌細胞Hep-2侵襲轉移的影響及其分子機制[J].貴州醫(yī)科大學學報，2019，44(02):178-183+189.
[2] 趙越，孫媛媛，佟雪，岳鵬杰，富偉能.miR-362-3p在喉癌組織中的表達及其對喉癌Hep-2細胞遷移的影響[J].中國醫(yī)科大學學報，2019(03):236-239.
[3] 唐甜，肖祝雅，曾峰.SHIP2對喉癌Hep-2細胞生物學行為的影響及對放療增敏的機制[J].武漢大學學報(醫(yī)學版)，2019，40(02):226-234.