不飽和直鏈烴例如α-鏈烯或1-烯烴是工業(yè)上重要類(lèi)型的分子,除了在燃料中使用外,其可以充當(dāng)潤(rùn)滑劑和表面活性劑。相比化合合成,有機(jī)化學(xué)物質(zhì)的生物合成可以提供高效的選擇性。因而，存在著對(duì)微生物菌株的需求,所述菌株可以產(chǎn)生提高產(chǎn)量的烴類(lèi),特別是末端烯烴。1-十九碳烯作為一種末端烯烴，在有機(jī)合成中的中間體，在合成潤(rùn)滑劑、表面活性劑和其他化學(xué)品中發(fā)揮著重要的作用。1-十九碳烯為無(wú)色液體，可溶于有機(jī)溶劑，不溶于水。
生物合成[1]
聚球藍(lán)細(xì)菌屬物種PCC 7002的敲除菌株的制備：在含有200mg/L壯觀霉素的A+培養(yǎng)基中的5ml培養(yǎng)物在150rpm在37℃在2% CO2/空氣和連續(xù)光照(70-130μE m2/s PAR,用LI-250A光度計(jì)(LI-COR)測(cè)量的)下在Infors搖動(dòng)孵化器中孵育,直到它的OD730達(dá)到1。對(duì)于每種質(zhì)粒,將500ul的培養(yǎng)物和5ug質(zhì)粒DNA添加到微離心管中。試管然后在250rpm在New Brunswick搖動(dòng)孵化器中在37℃在暗處孵育4h。每個(gè)轉(zhuǎn)化250ul然后接種在A+瓊脂平板上。平板在恒定的照明下在37°C下中Percival燈照孵化器中孵育約24小時(shí)過(guò)夜。在第二天,將慶大霉素溶液添加到平板的瓊脂的下方到最終估計(jì)的25mg/L慶大霉素濃度。將這些平板放回到孵化器中直到顯現(xiàn)細(xì)小的菌落。將平板移動(dòng)到處于相同條件下,只是在空氣中維持1%CO2的另一個(gè)Percival孵化器中(容許更快的生長(zhǎng))。來(lái)自每個(gè)轉(zhuǎn)化平板的兩個(gè)菌落在含有50mg/L慶大霉素的A+平板上劃線(xiàn),在 Percival孵化器(環(huán)境CO2濃度)中孵育直到出現(xiàn)菌落。
培養(yǎng)物在Infors孵化器中在~100uEm-2s-1光合活性輻射(PAR)的連續(xù)光照下在37°C在150rpm在2% CO2富集空氣中孵育四天。通過(guò)添加回milli-Q水來(lái)補(bǔ)償水分流失。進(jìn)行730nm(OD730)處的光密度測(cè)量。取出2.5ml的每種培養(yǎng)物,細(xì)胞使用Sorvall RC6Plus超高速離心機(jī)和F13S-14X50CY轉(zhuǎn)子(5000rpm 10分鐘)來(lái)團(tuán)?；Ｒ瞥囵B(yǎng)基上清液，細(xì)胞重懸浮在1ml Milli-Q水中。細(xì)胞再一次使用臺(tái)式離心機(jī)來(lái)團(tuán)?；瑏G棄上清液，細(xì)胞團(tuán)粒保存在-80℃等待分析1-十九碳烯的存在。
1-十九碳烯的檢測(cè)和定量
解凍細(xì)胞團(tuán)粒,添加含有100ml/L丁基化羥基甲苯(Sigma-Aldrich B1378)和50mg/L花生酸乙酯(Sigma A9010)的1ml等分量的丙酮(Acros Organics 326570010)。細(xì)胞團(tuán)粒渦旋15秒兩次(整個(gè)提取時(shí)間1-2分鐘)。懸浮液離心2分鐘來(lái)團(tuán)化碎屑,利用火焰電離檢測(cè)(GC/FID)或質(zhì)譜檢測(cè)(GC/MS)用氣相色譜儀來(lái)分析上清液。
裝備有7683系列自動(dòng)進(jìn)樣器的Agilent 7890A GC/5975C EI-MS被用于確認(rèn)1-十九碳烯的身份。1uL的每種樣品使用脈沖的不分流注射(壓力:20psi,脈沖時(shí)間:0.3分鐘,吹掃時(shí)間:0.2分鐘,清洗氣流:15mL/分鐘)來(lái)注射到GC進(jìn)口中,進(jìn)口溫度280℃。柱是HP-5MS(Agilent,30mx0.25mmx0.25um),運(yùn)載氣體是1.0mL/分鐘流動(dòng)的氦氣。GC烘箱溫度程序是50℃保持一分鐘;10℃/分鐘提高到280 ℃,保持十分鐘。GC/MS接口是290℃,監(jiān)視的MS范圍是25到600amu。JCC138的提取物中存在的峰具有與商業(yè)上可獲得的1-十九碳烯標(biāo)準(zhǔn)物(Fluka 74320)相同的保留時(shí)間(17.5分鐘)和質(zhì)譜,確認(rèn)了這個(gè)菌株的1-烯烴的生產(chǎn)。
裝備有7683系列自動(dòng)進(jìn)樣器的gilent 7890A GC/FID被用于定量1-十九碳烯。1uL的每種樣品來(lái)注射到GC進(jìn)口中(分流5:1,壓力:20psi,脈沖時(shí)間:0.3分鐘,吹掃時(shí)間:0.2分鐘,清洗氣流:15mL/分鐘),進(jìn)口處在280℃的溫度下。柱是HP-5MS(Agilent,30mx0.25mmx0.25um),運(yùn)載氣體是1.0mL/分鐘流動(dòng)的氦氣。GC烘箱溫度程序是50℃保持一分鐘;10℃/分鐘提高到280℃,保持十分鐘。使用1-十九碳烯標(biāo)準(zhǔn)物(rt 18.8)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),測(cè)定提取物中的濃度并標(biāo)準(zhǔn)化為花生酸乙酯(內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)物)的濃度[1]。
參考文獻(xiàn)
[1]焦耳無(wú)限科技公司. 在工程化的微生物中的1-烯烴的生物合成:CN201080037536.0[P]. 2012-07-11.