青霉素酶屬于-內(nèi)酰胺酶，可水解青霉素類的β-內(nèi)酰胺環(huán)，使抗生素失效。目前，青霉素酶常用于抗生素藥品質(zhì)量檢測、青霉素過敏者使用，該酶最具前景的用途是對牛奶中的青霉素殘留量的快速定量測定和對青霉素超標(biāo)牛乳進(jìn)行處理。它的常用產(chǎn)生菌為地衣芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌。
目前青霉素酶的活性測定普遍采用碘量法，此方法的原理是:青霉素在青霉素酶作用下降解，降解產(chǎn)物青霉噻唑酸能與碘發(fā)生反應(yīng)，根據(jù)青霉素酶分解青霉素前后消耗碘量的差值，計(jì)算出單位時間內(nèi)青霉素降解量，進(jìn)而折算出青霉素酶的活性。但是碘量法經(jīng)常受到其他因素的影響，例如反應(yīng)過程需要避光、反應(yīng)時間要準(zhǔn)確控制、滴定誤差較大、操作繁瑣、終點(diǎn)判斷不明顯等，因此系統(tǒng)誤差較大。
青霉素可快速與羥胺反應(yīng)，生成羥肟酸，后者與三價鐵離子可以形成水溶性內(nèi)絡(luò)鹽而顯紅色，在515nm光波下有最大吸收峰。1947年Ford首次應(yīng)用該原理建立了青霉素的檢測方法，1990年吳芝清等人又改進(jìn)了羥胺法，增加了顯色的穩(wěn)定性。青霉素酶能夠分解青霉素，如果青霉素酶的分解產(chǎn)物既不影響羥胺與青霉素的反應(yīng)，也不影響羥肟酸與三價鐵離子進(jìn)一步反應(yīng)，則可根據(jù)單位時間內(nèi)青霉素酶反應(yīng)前后羥胺法測得的青霉素含量的差值，進(jìn)而建立一種新的青霉素酶的檢測方法。相對于碘量法，羥胺法反應(yīng)時間短(5min)、顯色穩(wěn)定、數(shù)據(jù)重復(fù)性好、操作過程簡便、操作體系小(只有5mL)，因此比碘量法更有優(yōu)勢。
測定方法[1]
1、青霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
取80萬單位/瓶的青霉素鈉0.4000g用緩沖液溶解定容至100mL，分別取母液50、100、200、250、500、750uL加緩沖液補(bǔ)充至1.0mL。依次加入0.125mol/L中性羥胺1.0mL、95%乙醇1.0mL，反應(yīng)3min，再加入0.25mmol/L硫酸鐵胺2.0mL，混勻后，待反應(yīng)氣泡消失后，以緩沖溶液(pH6.0)代替青霉素標(biāo)準(zhǔn)液做為空白對照，測OD515值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
2、羥胺法測定樣品中的青霉素含量
將含青霉素的樣品適度稀釋，室溫下(20℃-28℃)取1.0mL樣品稀釋液，依次加0.125mol/L中性羥胺1.0mL、95%乙醇1.0mL，反應(yīng)3min，加入0.25mmol/L硫酸鐵胺2.0mL，混勻后，待反應(yīng)氣泡消失后，以緩沖溶液代替青霉素標(biāo)準(zhǔn)液做為空白，測OD515值，依照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出青霉素含量。
3、羥胺法測定青霉素酶活
酶活力單位數(shù):在37℃條件下，青霉素酶1h所分解的青霉素單位數(shù)稱為酶活力單位數(shù)。將待測青霉素酶液，適度稀釋(大約酶活在10000u/mL左右)，取10mL稀釋酶液與青霉素液(10000u/L)20mL混合均勻，37℃保溫水浴，分別用羥胺法測定水浴0h和水浴1h的青霉素含量，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出青霉素的降解量，進(jìn)而根據(jù)公式推算出青霉素酶的活性。
參考文獻(xiàn)
[1]王芳,儀宏,王麗麗. 羥胺法測定青霉素酶酶活的研究[J]. 中國抗生素雜志,2010,35(4):316-319.