研究背景
IGF-1是一種多功能細(xì)胞增殖調(diào)控因子，是由70個(gè)氨基酸組成的單鏈堿性多肽，主要由肝臟合成，分泌，具有胰島素樣合成代謝作用和促生長(zhǎng)作用。IGF-1 LR3在IGF-1 N端添加了十三個(gè)氨基酸，并且把IGF-1的第三位Glu(E)用Arg(R)代替，在1992年由Francis GL等人在大腸桿菌中高效表達(dá)。作為生物活性物質(zhì)，IGF-1 LR3必須低溫儲(chǔ)存，常見(jiàn)商售凍干粉形態(tài)如下圖。IGF-1 LR3比IGF-1活性高，體內(nèi)半衰期也延長(zhǎng)，具有更好的促生長(zhǎng)作用，能促進(jìn)多數(shù)細(xì)胞的分裂、遷移和分化。在多數(shù)體外試驗(yàn)中，IGF-1 LR3在濃度為0.2-20 ng ml的范圍內(nèi)就能很好發(fā)揮生物學(xué)活性。當(dāng)前用IGF-1 LR3做醫(yī)學(xué)研究，延緩衰老，健美等，有巨大的市場(chǎng)需求[1]。
合成研究
天然的胰島素生長(zhǎng)因子1(IGF-1)是由70個(gè)氨基酸組成的單鏈堿性多肽，在IGF-1前端加13個(gè)氨基酸，并且把IGF-1的第三位Glu(E)用Arg(R)代替即可合成IGF-1 LR3。具體地，先把IGF-1 LR3基因克隆至大腸桿菌表達(dá)載體pET32a中，經(jīng)篩選，序列測(cè)定和酶切鑒定證實(shí)表達(dá)載體pET32-LR3-IGF1構(gòu)建成功。重組的胰島素樣生長(zhǎng)因子在Rosetta(DE3)plysS中獲得高效表達(dá)，目的蛋白約占菌體總蛋白的30%，40L發(fā)酵罐中的蛋白質(zhì)水平可達(dá)1.73g/kg。菌體經(jīng)超聲破碎制備包涵體，經(jīng)變性，復(fù)性，SP-F.F，Phenyl-F.F層析和Sephacryl S-100凝膠過(guò)濾三步純化，得到分子量為9.1kD單一條帶的目的蛋白，經(jīng)高效液相HPLC分析純度達(dá)到98%，目的蛋白的收率為30%，生物活性鑒定重組的胰島素樣生長(zhǎng)因子具有刺激Bale/3T3細(xì)胞增長(zhǎng)的特異性，其ED50在1.0ng/ml左右。這種重組類(lèi)似物在體外與天然的IGF-1相比能更好的與受體結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育，可用于體外細(xì)胞表達(dá)外源蛋白的大規(guī)模培養(yǎng)及臨床輔助用藥[2]。
應(yīng)用
文獻(xiàn)報(bào)道了一種用于增強(qiáng)雄性勃起功能的藥物組合物，其包含與藥學(xué)可接受的稀釋劑或載體混合的勃起功能增強(qiáng)量的胰島素樣生長(zhǎng)因子。其中，胰島素樣生長(zhǎng)因子選自IGF-1(生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素-C)和類(lèi)似物IGF-1 LR3。這類(lèi)組合物任選地還包含選自雄激素特別是睪酮和二氫睪酮，血管擴(kuò)張劑，PDE5抑制劑和前列腺素E1的化合物[3]。
測(cè)定
IGF-1 LR3的測(cè)定分析可以借助酶聯(lián)免疫分析(ELISA)實(shí)現(xiàn)。市面常見(jiàn)的酶聯(lián)檢測(cè)試劑盒應(yīng)用夾心法測(cè)定標(biāo)本中IGF-1 LR3水平。用純化的牛胰島素樣生長(zhǎng)因子 (IGF-1 LR3)抗體包被微孔板，往微孔中依次加入(IGF-1 LR3)，再與HRP標(biāo)記的胰島素樣生長(zhǎng)因子 (IGF-1 LR3)抗體結(jié)合，形成免疫復(fù)合物，經(jīng)過(guò)徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的胰島素樣生長(zhǎng)因子 (IGF-1 LR3)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(OD值)，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算樣品中胰島素樣生長(zhǎng)因子 (IGF-1 LR3)濃度[4]。
參考文獻(xiàn)
[1]任慧慧.LR3-IGF-I基因工程菌的構(gòu)建、表達(dá)及純化[D].山西大學(xué),2008.
[2]劉洪霞.胰島素樣生長(zhǎng)因子1重組類(lèi)似物的研究[D].吉林大學(xué),2006.
[3]K·W·亞當(dāng)斯.用于增強(qiáng)雄性勃起功能的方法和組合物:CN200980149143.6[P].
[4]中國(guó)化工儀器網(wǎng).牛胰島素樣生長(zhǎng)因子 (IGF-1 LR3)酶聯(lián)免疫分析(ELISA)[J].試驗(yàn)機(jī).