背景[1-6]
快速DNA連接模塊是針對Illumina高通量測序平臺文庫構建專業(yè)設計的DNA連接模塊。本產(chǎn)品可在雙鏈平末端DNA片段或雙鏈3′-dA DNA片段的兩端連接Illumina測序平臺適用的DNA接頭，具有連接效率高、簡便、可實現(xiàn)自動化等優(yōu)勢。
Fast Pace T4 DNA Ligase：
1.SDS-PAGE純度：>95%。
2.16小時孵育檢測：50μL反應體系中包含5μl本酶和1μg HindIII-λDNA，37°C下孵育16小時。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，條帶無降解；50μL反應體系中包含5μl本酶和1μg T3 DNA，37°C下孵育16小時。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，條帶無降解。
3.RNase活性：5μl本酶中加入40 ng FAM-RNA及，37°C下孵育16小時。經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，條帶無降解。
4.核酸內(nèi)切酶活性：50μL反應體系中加入5μl本酶和1μgφX174 RF I DNA，37°C下孵育4小時。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，RF II轉化比率<10%。
5.核酸外切酶活性：50μL反應體系中加入至少5μl本酶和1μg聲振的[3H]DNA（105 cpm/μg），37°C下孵育4小時，釋放的放射性<0.1%。
6.功能活性（平末端連接）：50μL反應體系，在1×Fast Pace Ligation Buffer中，加入0.5µL Fast Pace T4 DNA Ligase，18μgHaeIIIφX174，16°C孵育7.5分鐘。經(jīng)瓊脂糖電泳檢測，片段連接率>95%。
7.功能活性（接頭連接）：50μL反應體系，在1×Fast Pace Ligation Buffer中，加入0.125µL Fast Pace T4 DNA Ligase，8 nmol 12 bp接頭，16°C孵育過夜。經(jīng)瓊脂糖電泳檢測，無明顯未連接接頭。
Fast Pace Ligation Buffer：
1.16小時孵育檢測：50μL反應體系中包含1×Fast Pace Ligation Buffer和1μg HindIII-λDNA，37°C下孵育16小時。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，條帶無降解；50μL反應體系中包含1×Fast Pace Ligation Buffer和1μg T3 DNA，37°C下孵育16小時。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，條帶無降解。
2.核酸內(nèi)切酶活性：50μL反應體系中包含1×Fast Pace Ligation Buffer和1μgφX174 RF I DNA，37°C下孵育4小時。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，RF II轉化比率<10%。
3.RNase活性：在1×Fast Pace Ligation Buffer中加入40 ng FAM-RNA，37°C下孵育16小時。經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，條帶無降解。
4.磷酸酶活性檢測：在磷酸酶活性檢測緩沖液中加入1×Fast Pace Ligation Buffer和2.5 mM對硝基苯磷酸，37°C下孵育4小時。經(jīng)光譜測定法檢測，405 nm處無對硝基苯陰離子特征吸收峰。
應用[7][8]
快速DNA連接模塊可用于快速構建DNA文庫：
隨著基因檢測,免疫試紙條等檢測工具的廣泛應用,酶介導的生物化學檢測越來越受到人們的重視。然而隨著人類生活水平的不斷提高,傳統(tǒng)工具酶已經(jīng)無法滿足人們的需求。蛋白質的定向進化,是在短時間內(nèi)改變酶的結構和性質最主要的手段,通過不斷的體外進化,可以得到對環(huán)境耐受性較強,催化活性較高的進化酶。蛋白質的定向進化技術現(xiàn)已成功應用于上百種酶的進化,在生產(chǎn)生活領域產(chǎn)生了巨大影響。
蛋白質的定向進化主要有兩種手段,一類是以易錯PCR為代表的,基于基因突變原理構建突變體文庫。這種方法所構建的突變體文庫多樣性較高,但有效性較低,且無法應用于同源性低的DNA片段;另一類是以DNA shuffling為代表的,基于基因重組原理構建組合文庫。該方法不僅可以將同源性較低的DNA片段隨機組合,而且可以將不同生物體的非同源基因進行重組,極大的豐富了DNA重組范圍,有效性較高,但多樣性較低。
針對現(xiàn)有構建組合文庫方法的缺點,以卡那霉素抗性蛋白為研究對象,設計了一種多模塊組裝構建組合文庫的新方法。該方法從天然存在的蛋白質中提取二級結構元件為模塊,在模塊兩端設計可被Hinf I限制性核酸內(nèi)切酶消化的Linker,隨后將消化的DNA模塊以有義方向隨機連接,并通過PCR對重組的目的片段進行擴增。然后通過與實驗室自制的SV載體的連接、轉化和篩選,構建組合文庫。
通過篩選,實驗得到了10~5個陽性克隆。通過對500個克隆的電泳分析,可知插入的重組DNA片段大小不一,具有較好的多樣性;通過對20個克隆的測序的比對分析,可知其與野生型蛋白完全不同,且各模塊均為正向連接,說明該文庫多樣性好,有效性高;通過對插入片段長度的統(tǒng)計分析,不同插入片段模塊組成的分析,不同二級結構模塊連接概率分析和模塊長度與連接概率的關聯(lián)分析,充分說明了所構建的組合文庫各模塊連接的隨機性。
開發(fā)出了一種全新的能夠實現(xiàn)模塊隨機組裝的文庫構建新方法,通過簡單地操作流程,DNA模塊可以完全隨機組裝成DNA片段。從理論上說,該方法可以構建一個M^N(M:模塊的組裝數(shù)量,N:模塊數(shù))的龐大組合文庫。由于本實驗DNA模塊是隨機組裝的,所以該方法有助于研究蛋白的結構與功能之間的關系,此外,構建的隨機組合文庫為計算機模擬高通量蛋白質篩選以及合成生物學提供了方法借鑒。
參考文獻
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