背景及概述^[1]

金雞納樹皮中的一種生物堿。辛可寧的立體異構(gòu)體。有左旋光性。熔點(diǎn)210℃。難溶于水，溶于乙醇。硫酸辛可尼丁三水物是針狀晶體。溶于水和乙醇。無水物熔點(diǎn)約240℃(分解)。與奎寧相像，具有抗瘧作用?？稍诮痣u納樹皮提取液中分出奎寧后，母液以堿處理，析出生物堿，加入酒石酸使其成為難溶的酒石酸鹽分離而得。

應(yīng)用

硫酸辛可尼丁對腫瘤細(xì)胞生長的影響，硫酸辛可尼丁可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，以抑制腫瘤細(xì)胞生長，促進(jìn)腫瘤的早期凋亡，并增強(qiáng)了促進(jìn)細(xì)胞凋亡因子的表達(dá)，抑制了抑制凋亡因子的表達(dá)。硫酸辛可尼丁有望于今后在抗腫瘤方面應(yīng)用。

1.硫酸辛可尼丁對腫瘤細(xì)胞生長的影響：用含有10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)子宮頸癌細(xì)胞系HeLa細(xì)胞、人乳腺腺癌上皮細(xì)胞系MCF7細(xì)胞和人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞系，分別以4600個/孔的細(xì)胞密度接種到96孔板，培養(yǎng)24小時(h)后，分別加入1，5，10，50，100，250μmol/L濃度的辛可寧丁，分別培養(yǎng)48h，72h和96h后用MTT法測細(xì)胞生長狀況，其結(jié)果顯示硫酸辛可尼丁有濃度依存性地抑制HeLa細(xì)胞的生長。

MTT法：每孔加入5mg/ml的MTT溶液20μl，培養(yǎng)箱中孵育3小時后取出，棄去上清，每孔加150μl二甲基亞砜溶解甲瓚沉淀，用酶標(biāo)儀在490nm下測定吸光度值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明硫酸辛可尼丁可以抑制HeLa細(xì)胞(A)，MCF7細(xì)胞(B)和A549細(xì)胞(C)，表明硫酸辛可尼丁有抗腫瘤活性。

2.早期細(xì)胞凋亡的檢測-流式細(xì)胞：為了研究辛可寧抑制腫瘤細(xì)胞生長的機(jī)制，進(jìn)一步探討了它們對HeLa細(xì)胞的早期細(xì)胞凋亡的影響。方法如下：用含有10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)HeLa細(xì)胞，接種于6cm細(xì)胞培養(yǎng)皿，調(diào)整細(xì)胞密度，培養(yǎng)24h后，加硫酸辛可尼丁時細(xì)胞密度在40％左右，分別加入100，150，180μmol/L濃度的辛可寧，分別作用48h后用流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞早期凋亡。

流式細(xì)胞術(shù)：培養(yǎng)細(xì)胞與6cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，加辛可寧刺激后，收集細(xì)胞，PBS洗2遍，1500-2000rpm離心5min，棄去上清，加入BindingBuffer100μl，磷脂酰絲氨酸結(jié)合蛋白(AnnexinV)-FITC5μl，碘化丙啶(PI)5μl，室溫暗處反應(yīng)30min后，加400μlBindingBuffer，上樣檢測細(xì)胞早期凋亡。結(jié)果顯示硫酸辛可尼丁提高了HeLa細(xì)胞的AnnexinV和PI的表達(dá)，表明硫酸辛可尼丁能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的早期凋亡。

3.泛素化Akt(Ub-Akt)和磷酸化Akt(p-Akt)的檢測：

LPS可以促進(jìn)Akt泛素化和磷酸化，為了探討硫酸辛可尼丁的作用途徑，我們研究了化合物能否阻止Akt的泛素化和磷酸化。用含有10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)HeLa細(xì)胞，接種于6cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，調(diào)整細(xì)胞密度，使加化合物時細(xì)胞密度達(dá)到70％-80％，加180μmol/L的硫酸辛可尼丁分別刺激1、2和3h。然后加20μg/ml的LPS刺激3h后，提取總蛋白。用ProteinASepharosebeads沉淀Akt蛋白，Westernblot法檢測泛素化Akt的變化，以β-actin作為內(nèi)參蛋白。加180μmol/L的硫酸辛可尼丁分別刺激3、6、12和24h。然后加20μg/ml的LPS刺激3h后，提取總蛋白。用Westernblot法測定磷酸化Akt的變化，以β-actin作為內(nèi)參蛋白。

Western：提取細(xì)胞總蛋白，應(yīng)用BCA蛋白定量法得出提取蛋白的濃度，按每孔40μg上樣。吸取蛋白樣品，按1：4比例加入5×loadingbuffer，煮沸10min，上樣，跑SDS電泳，80V，20min，120V，1h。電泳結(jié)束后，用半干轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)印槽于23V，轉(zhuǎn)印1h。取出PVDF膜，TBST洗6次，每次5min，5％脫脂奶粉封閉2h。轉(zhuǎn)入5％BSA稀釋的p-Akt(308/473)、Akt、泛素化抗體或β-actin抗體中，4℃搖過夜。第二天，取出PVDF膜，TBST洗膜后轉(zhuǎn)入5％脫脂牛奶稀釋的通用二抗中，孵育40min，TBST洗40-50min，加入eECL，反應(yīng)1-2min，暗室曝光。結(jié)果顯示，硫酸辛可尼丁可以有效地阻止LPS引起的Akt的泛素化和磷酸化。

4.泛素化TAK1(Ub-TAK1)和磷酸化TAK1(p-TAK1)的檢測：

LPS可以促進(jìn)TAK1泛素化和磷酸化，為了探討硫酸辛可尼丁的作用途徑，研究了化合物能否阻止TAK1的泛素化和磷酸化。用含有10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)HeLa細(xì)胞，接種于6cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，調(diào)整細(xì)胞密度，使加化合物時細(xì)胞密度達(dá)到70％-80％，加180μmol/L的硫酸辛可尼丁分別刺激3、6、12和24h。然后加1μg/ml的LPS刺激15min后，提取總蛋白。用ProteinASepharosebeads沉淀TAK1蛋白，Westernblot法檢測泛素化TAK1的變化，以β-actin作為內(nèi)參蛋白。結(jié)果顯示，硫酸辛可尼丁可以有效地阻止LPS引起的TAK1的泛素化和磷酸化。

5.細(xì)胞凋亡相關(guān)因子的檢測(Bax/Bcl)：

探討化合物對細(xì)胞凋亡相關(guān)因子Bax和Bcl的表達(dá)。用含有10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)HeLa細(xì)胞(購自沈陽萬類生物科技有限公司)，接種于6cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，調(diào)整細(xì)胞密度，培養(yǎng)24h后，加辛可寧時細(xì)胞密度在40％左右。每皿細(xì)胞加入180μmol/L的辛可寧，分別刺激12h、24h、48h、72h、96h。提取細(xì)胞總蛋白，用Westernblot法檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)因子Bax/Bcl的表達(dá)。

結(jié)果顯示從加硫酸辛可尼丁24h后Bax的表達(dá)有所提高，而Bcl的表達(dá)被抑制，48h后此現(xiàn)象更加明顯，Bax是凋亡促進(jìn)蛋白，而Bcl是凋亡抑制蛋白，此結(jié)果進(jìn)一步支持硫酸辛可尼丁促進(jìn)了細(xì)胞凋亡。

主要參考資料

[1] 簡明精細(xì)化工大辭典

[2] CN201710142634.4硫酸辛可尼丁在制備抗腫瘤藥物的用途