背景技術(shù)

氰戊菊酯是一種應(yīng)用廣泛的擬除蟲菊酯類殺蟲劑,對危害棉花、果蔬、茶、大豆、小麥等農(nóng)作物的鱗翅目、同翅目、直翅目、半翅日害蟲的幼蟲有良好的防治效果,也可防治地老虎等夜蛾科害蟲川。氰戊菊酯對大鼠的毒性中等,對魚和其它水生生物毒性大。人誤服氰戊菊酯可引起嘔吐、神經(jīng)過敏、悸懼、流誕等癥狀,嚴(yán)重時發(fā)生震顫和全身痙攣。目前,氰戊菊酯是我國擬除蟲菊酯類農(nóng)藥中使用量最大的品種,農(nóng)產(chǎn)品中氰戊菊酯殘留超標(biāo)直接影響食品安全,對環(huán)境構(gòu)成一定威脅。我國強制性國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定,氰戊菊酯最大殘留限量:葉菜類為0.5mg/kg,谷類(原糧)、果類菜、水果為0.2mg/kg,根塊類為0.05mg/kg。歐盟最近將氰戊菊酯定為農(nóng)產(chǎn)品中不得檢出的農(nóng)藥品種,嚴(yán)重影響我國茶葉等農(nóng)產(chǎn)品的出口。

目前已報道的氰戊菊酯殘留檢測方法主要有高效液相色譜法、氣相色譜法和氣質(zhì)聯(lián)用法。采用這些方法需要比較昂貴的儀器設(shè)備、專業(yè)化的實驗窒和訓(xùn)練有素的專門人才,對樣品前處理的要求高、速度慢,難以適應(yīng)大量祥本和現(xiàn)場快速檢測的要求。免疫分析具有特異性強、靈敏度高、方便快捷、廉價高效、不需要貴重儀器及可多個樣品同時測定等優(yōu)勢。國外報道以順式氰戊菊酯整個分子的衍生物為半抗原制備免疫原,免疫動物所獲抗體與其它一些結(jié)構(gòu)類似的擬除蟲菊酯類農(nóng)藥有較明顯的交叉反應(yīng),所建立的間接競爭免疫分析法步驟較多。本文建立了氰戊菊酯的直接競爭酶聯(lián)免疫吸附分析技術(shù),操作簡便、快速,特異性高,為氰戊菊酯殘留的快速檢測提供了一種新方法。

測定方法

1、氰戊菊酯人工抗原的制備與鑒定：采用活性酯法,將氰戊菊酯半抗原N-[2-(4-氯苯基)-3-甲基丁酰基]4-氨基丁酸與BSA(或OVA)共價偶聯(lián),反應(yīng)液在0.01mol/L pH7.2 PBS中4℃透析,偶聯(lián)物凍干后于-20℃保存。精確配制偶聯(lián)物、載體蛋白和半抗原溶液5mL,根據(jù)半抗原、載體蛋白質(zhì)和偶聯(lián)物的紫外掃描圖譜鑒定半抗原是否與載體蛋白質(zhì)有效偶聯(lián),根據(jù)三者在波長265nm處的摩爾吸光系數(shù)(ε)估算半杭原與載體蛋白質(zhì)結(jié)合的摩爾比,結(jié)合比(X)=[(ε_{偶聯(lián)物}-ε_載體蛋白)/ε_半抗原]?？蓪嶒灁?shù)據(jù)代入公式(M_p+XM_H)?A_c/m_c=M_p?A_p/m_p+XM_H?A_H/m_H計算(式中,(M_p+XM_H)、M_p和M_H分別為偶聯(lián)物、載體蛋白和半抗原的分子量;A_c、A_p和A_H分別為偶聯(lián)物、載體蛋白和半抗原溶液在265nm處的吸光值;m_c、m_p和m_H分別為配置溶液時所用偶聯(lián)物、載體蛋白和半抗原的質(zhì)量,X為結(jié)合比)。選擇結(jié)合比15:1~30:1的偶聯(lián)物作人工抗原。

2、抗體的制備與純化：按常量法以人工抗原免疫健康新西蘭白兔,免疫前兔耳緣靜脈采血分離血清作陰性對照。首次用弗氏完全佐劑乳化人工抗原免疫,以后每隔兩尾期用弗氏不完全佐劑乳化人工.抗原加強免疫。待瓊脂雙擴散法測定抗血清效價達64:1,兔頸動脈采全血分離血清,(NH₄)₂SO₄分步鹽析和DEAE纖維素柱層析法分離純化抗血清中的抗體,抗體凍干后于-20℃保存。

3、酶標(biāo)半抗原的制備：采用混合酸酐法將半抗原N-[2-(4-氯苯基)-3-甲基丁酰基]6-氨基己酸,與辣根過氧化物酶共價偶聯(lián),反應(yīng)液在4℃條件下于0.01mol/L pH7.2 PBS中透析,用聚乙二醇濃縮至適當(dāng)體積,葡聚糖凝膠G-50柱層析純化后加等量丙三醇混勻,-20℃保存。包被抗體直接ELISA法測定酶標(biāo)半抗原的效價。

4、氰戊菊酯直接競爭ELISA法的建立與條件優(yōu)化：采用直接競爭ELISA模式考察氰戊菊酯對酶標(biāo)半抗原與抗體結(jié)合的抑制活性,從而確定抗體與氰戊菊酯的親合力。分別用2、4、6、8和10mg/L抗體包被聚苯乙烯微孔板,酶標(biāo)半抗原稀釋6000、8000、10000、12000、14000和16000倍,方陣實驗法對ELISA工作條件(包括抗體和酶標(biāo)半抗原的工作濃度、包被與反應(yīng)介質(zhì)等)進行篩選,選擇氰戊菊酯對酶標(biāo)半抗原與抗體結(jié)合反應(yīng)的抑制率高、氰戊菊酯空白對照的A₄₉₀≈1.0、酶標(biāo)半抗原和抗體用量少的實驗組合為最佳工作條件組合。在優(yōu)化條件下,測定不同濃度氰戊菊酯對抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的抑制率I(%),I=100[(A_對照-A_氰戊菊酯)/A_對照],繪制I對氰戊菊酯濃度(logC)的標(biāo)準(zhǔn)曲線,建立同歸方程I= BlogC+A并進行相關(guān)分析,計算抑制率達50%、20%時氰戊菊酯的濃度(IC₅₀、IC₂₀),在實際樣品測定時以IC₂₀為有效檢出限[1]。

參考文獻

[1] 尤海琴,劉浪,劉曙照. 直接競爭酶聯(lián)免疫吸附分析法測定氰戊菊酯[J]. 分析化學(xué),2009,37(4):577-580. DOI:10.3321/j.issn:0253-3820.2009.04.020.