前言

羊毛甾醇又名異膽固醇,化學(xué)名為(3β)-8,24羊毛甾二烯3-醇,為白色無(wú)臭粉末,屬于四環(huán)三萜類化合物,是膽甾醇生物合成的中間體。羊毛甾醇是存在于羊毛脂內(nèi)一種重要的甾醇類,具有重要的生理作用,如抗癌、降血壓、消炎、緩解實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的白內(nèi)障病情等。有文獻(xiàn)提出了羊毛甾醇具有緩解和預(yù)防白內(nèi)障進(jìn)展的作用以及對(duì)結(jié)腸癌具有一定的化學(xué)預(yù)防作用,也是化妝品,醫(yī)藥,化工行業(yè)中的一種重要原料。

羊毛甾醇的分子式是C₃₀H₅₀O;分子量426;熔點(diǎn)140℃~141℃;溶于氯仿、乙醇、乙醚。羊毛甾醇合成的第一個(gè)關(guān)鍵步驟為2,3-環(huán)氧角鯊烯環(huán)化形成羊毛甾醇(LA)或環(huán)木菠蘿烯醇(CA),通過(guò)氧化角鯊烯環(huán)化酶(OSC)催化,LA和CA可通過(guò)一系列酶反應(yīng)轉(zhuǎn)化成各種甾醇。

本文使用高效液相色譜(HPLC)法對(duì)羊毛甾醇進(jìn)行含量測(cè)定,該方法更為簡(jiǎn)便且準(zhǔn)確度高,效果較為理想,為羊毛甾醇的含量分析及相關(guān)研究提供了更簡(jiǎn)便、可靠的方法。

檢測(cè)方法^[1]

1、色譜條件

色譜柱:InfinityLab Poroshell 120 Ee-C₁₈(4.6x150mm,5um);柱溫:35℃;流動(dòng)相:100%甲醇;流速:1.0mL?min^-1;檢測(cè)波長(zhǎng):210nm;進(jìn)樣量:10uL;洗脫方式:等度洗脫。

2、溶液的制備

2.1對(duì)照品溶液制備：取羊毛甾醇對(duì)照品適量,精密稱定,加甲醇溶解并稀釋成每1mL中約含0.1mg羊毛甾醇的溶液,搖勻,作為對(duì)照品溶液。

2.2供試品溶液制備：稱取羊毛甾醇原料約10.00mg,精密稱定,置100mL棕色量瓶中,加入適量甲醇,超聲使溶解,用甲醇稀釋至刻度,搖勻,作為供試品溶液。

3、系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

分別取甲醇、羊毛甾醇對(duì)照品溶液10uL,按“1”項(xiàng)下色譜條件注入色譜儀進(jìn)行測(cè)定,羊毛甾醇與甲醇的峰分離度良好。

另取氧化破壞實(shí)驗(yàn)樣品溶液10uL,按“1”項(xiàng)下色譜條件注入色譜儀進(jìn)行測(cè)定,羊毛甾醇峰與相鄰雜質(zhì)峰分離度均大于1.5,主峰純度在998以上,理論塔板數(shù)大于10000(理論塔板數(shù)=3000)。

4、專屬性試驗(yàn)

取羊毛甾醇原料共6份,每份10mg,精密稱定，分別置10mL燒杯中,按以下方法進(jìn)行處理。①酸破壞:加入0.1mol?L^-1HCl溶液1mL,置60℃水浴中破壞60min;②堿破壞:加入0.1mol?L^-1 NaOH 溶液1mL,置60℃水浴中破壞60min;③光照破壞:置可見光光照5000Lux下破壞3d;④高濕破壞:于室溫、濕度大于85%的環(huán)境下破壞3d;⑤氧化破壞:加入3%H2O2溶液1mL,置60℃水浴中破壞60min;⑥高溫破壞:置鼓風(fēng)干燥箱中105℃加熱30min。取上述溶液,分別轉(zhuǎn)移到50mL棕色量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,搖勻即得。取稀釋后的溶液各10uL,按“1”項(xiàng)下色譜條件注入色譜儀進(jìn)行測(cè)定,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,羊毛甾醇峰與其相鄰雜質(zhì)峰均能達(dá)到完全分離,分離度均大于1.5,理論塔板數(shù)均符合規(guī)定,方法的專屬性良好。

5、重復(fù)性試驗(yàn)

取羊毛甾醇原料10mg,精密稱定,置100mL棕色量瓶中,加入適量甲醇,超聲使溶解,用甲醇稀釋至刻度,搖勻即得,平行制備6份。取上述溶液各10μL,按“1”項(xiàng)下色譜條件注入色譜儀進(jìn)行測(cè)定,含量測(cè)定的結(jié)果RSD為1.2%,表明方法重復(fù)性良好。

6、線性范圍

取羊毛甾醇對(duì)照品適量,精密稱定,用甲醇配制成系列濃度溶液,濃度分別為:0.04849mg?mL^-1、0.06462mg?mL^-1、0.08078mg?mL^-1、0.09694mg?mL^-1、0.1131mg?mL^-1,按“1”項(xiàng)下色譜條件注入色譜儀進(jìn)行測(cè)定,記錄峰面積;以峰面積(y)為縱坐標(biāo),濃度(x)為橫坐標(biāo),建立回歸方程,線性回歸方程為y=4 638.7534x+61.8350,相關(guān)系數(shù)為1.0000;試驗(yàn)結(jié)果表明在0.04849mg?mL^-1~0.1131mg?mL^-1的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

7、儀器精密度試驗(yàn)

取“2.1”項(xiàng)下羊毛甾醇對(duì)照品溶液按“1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣8次進(jìn)行測(cè)定,記錄峰面積，RSD為0.2%(n=8),結(jié)果表明儀器精密度良好。

8、檢測(cè)限及定量限

精密量取“2.1”項(xiàng)下的羊毛甾醇對(duì)照品溶液適量,用甲醇逐級(jí)稀釋成系列濃度,按照“1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定,記錄色譜圖。以信噪比S/N =3:1計(jì)算檢測(cè)限,以信噪比S/N =10:1計(jì)算定量限。檢測(cè)限為0.008mg?ml^-1,定量限為0.08mg?mL^-1。

9、溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.1”項(xiàng)下羊毛甾醇對(duì)照品溶液及“2.2”項(xiàng)下羊毛甾醇供試品溶液,按照“1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定,在室溫放置0、6、8、12、24、48h后峰面積的變化,計(jì)算RSD值,對(duì)照品溶液主峰面積的RSD值為1.1%,3個(gè)廠家的供試品溶液主峰面積的RSD分別為1.6%.1.0%和1.1%,結(jié)果表明對(duì)照品溶液和供試品溶液在48h內(nèi)穩(wěn)定。

10、耐用性試驗(yàn)

取“2.1”項(xiàng)下羊毛甾醇對(duì)照品溶液,按照“1”項(xiàng)下的色譜條件,分別考察了流動(dòng)相比例,流速,柱溫變化,羊毛甾醇峰的理論板數(shù)均符合規(guī)定(理論塔板數(shù)>3000),羊毛甾醇峰與相鄰雜質(zhì)峰的分離度均大于1.5。

另取GL Sciences Intertsil ODS-SP C₁₈(4.6x150mm,5um)色譜柱,取“2.1”項(xiàng)下羊毛甾醇對(duì)照品溶液，按照“1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定,記錄峰面積并與“6”項(xiàng)下羊毛甾醇對(duì)照品溶液峰面積比較,RSD為0.3%,且光譜純度均大于0.999,結(jié)果表明方法耐用性良好。

11、樣品含量的測(cè)定

取“2.1"項(xiàng)下羊毛甾醇對(duì)照品溶液及“2.2”項(xiàng)下3個(gè)批次的羊毛甾醇樣品溶液,按照“1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定,記錄色譜圖,按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算各個(gè)批次羊毛甾醇含量,檢測(cè)結(jié)果見下表。

參考文獻(xiàn)

[1] 錢紹安,梁云,臧廣喜,等. HPLC法測(cè)定羊毛甾醇含量研究[J]. 中國(guó)藥物評(píng)價(jià),2021,38(6):513-517. DOI:10.3969/j.issn.2095-3593.2021.06.010.