梭菌屬均為嚴(yán)格厭氧芽孢菌，檢測(cè)需配套還原型厭氧培養(yǎng)基，整套體系分為通用增菌、選擇性分離、生化鑒定三類，強(qiáng)化梭菌培養(yǎng)基（RCM）是藥典規(guī)定的梭菌通用基礎(chǔ)測(cè)定培養(yǎng)基，市面成品 “梭菌屬測(cè)定用培養(yǎng)基” 為改良型選擇性瓊脂，配套完成梭菌全流程檢測(cè)。

應(yīng)用

試驗(yàn)以從河南省鄢陵縣農(nóng)戶肉豬養(yǎng)殖場(chǎng)中采集的新鮮豬糞為樣本,經(jīng)過(guò)梭菌屬測(cè)定用培養(yǎng)基(RCM)富集和TSN選擇性瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行分離篩選和生理生化鑒定,得到2株菌株,分別命名為B1和B3。馮騰柱等人通過(guò)提取菌株DNA,并對(duì)16S rDNA序列進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序,根據(jù)其同源性親疏建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),二者均被鑒定均為丁酸梭菌(Clostridium butyricum)。對(duì)2株菌的發(fā)酵特性進(jìn)行測(cè)定,分析發(fā)酵液中菌濃度、pH值、還原糖、乙酸和丁酸含量隨時(shí)間的變化。結(jié)果表明,B1和B3菌株在葡萄糖利用和乙酸的代謝水平上存在差異[1]。

董秀梅等人為探究黑龍江省某動(dòng)物園狼急性死亡病例的病原菌及其生物學(xué)特性,本研究采集病死狼心血、肝、脾及頜下淋巴結(jié)樣品,經(jīng)細(xì)菌分離純化,結(jié)果顯示,上述樣品接種鮮血瓊脂培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)24h后可見(jiàn)灰白色、雙層溶血環(huán)的菌落,在梭菌屬測(cè)定用培養(yǎng)基上形成黑色圓形菌落;革蘭染色鏡檢可見(jiàn)單個(gè)或呈短鏈狀排列的革蘭陽(yáng)性粗大桿菌。通過(guò)生化試驗(yàn)和16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增及序列分析對(duì)分離菌進(jìn)行鑒定,并進(jìn)一步經(jīng)PCR擴(kuò)增確定分離菌的毒素型。生化試驗(yàn)結(jié)果顯示,分離菌能發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖,且還原性硝酸鹽試驗(yàn)、明膠液化和牛奶爆裂發(fā)酵均呈陽(yáng)性,且無(wú)運(yùn)動(dòng)性;16SrRNA基因、毒素基因的PCR擴(kuò)增和遺傳進(jìn)化分析結(jié)果表明分離菌為A型產(chǎn)氣莢膜梭菌,命名為HLJ15-2。經(jīng)多序列位點(diǎn)分型分析(MLST)確定分離菌的ST型,結(jié)果顯示分離菌為ST221型,屬于雞源菌。采用K-B紙片擴(kuò)散法對(duì)分離菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn),結(jié)果顯示該菌對(duì)氟苯尼考、頭孢呋辛鈉、頭孢噻肟等磺胺類和喹諾酮類抗菌藥敏感。小鼠分別經(jīng)腹腔接種10倍倍比稀釋(5.21×10⁵cfu/mL-1.52x10⁹cfu/mL)的HLJ15-2菌液,計(jì)算該菌對(duì)小鼠的半數(shù)致死量(LD50),采集病死小鼠肝、脾、腸進(jìn)行組織病理學(xué)觀察分析分離菌對(duì)小鼠的致病性,結(jié)果顯示分離菌LD₅₀為2.26×10⁷cfu/mL,剖檢小鼠可見(jiàn)肝臟、脾臟均有出血,腸道膨隆,腸黏膜充血,組織病理切片觀察可見(jiàn)肝內(nèi)各級(jí)血管淤血,肝細(xì)胞條鎖狀排列消失,胞漿內(nèi)出現(xiàn)大小不等的空泡;脾臟紅髓比例增加,白髓部分細(xì)胞壞死;腸絨毛斷裂,黏膜固有層上皮細(xì)胞增生、黏膜下層紅細(xì)胞增多、充血、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。本研究首次報(bào)道了致病性A型產(chǎn)氣莢膜梭菌可感染狼,并導(dǎo)致其急性死亡,為野生動(dòng)物梭菌性傳染病的診斷與防控提供參考[2]。

參考文獻(xiàn)

[1] 馮騰柱,李市場(chǎng),龔明貴,等. 豬糞便中丁酸梭菌的分離與鑒定[J]. 飼料研究,2021,44(21):79-82. DOI:10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.21.017.

[2] 董秀梅,李秀云,劉念,等. 狼源產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離鑒定及分子分型[J]. 中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2022,44(8):831-836. DOI:10.3969/j.issn.1008-0589.202201001.