背景及概述^[1]

成骨細胞系生長期骨的一種細胞。此種細胞多聚集在新形成的骨質(zhì)表面。成骨細胞呈矮柱狀或立方形，排列較規(guī)則整齊，很象單層上皮細胞?？梢娂毎斐黾毝痰耐黄鹋c相鄰的細胞連接。胞核位于細胞的一端，有明顯核仁。胞漿呈嗜堿性，內(nèi)有線粒體和高爾基體。當(dāng)成骨細胞功能活動旺盛時，胞漿中可顯示堿性磷酸酶的活性、PAS陽性反應(yīng)的小顆粒，胞漿中含有大量的RNA。成骨細胞具有產(chǎn)生細胞間質(zhì)中纖維和粘多糖蛋白的作用。新的細胞間質(zhì)不斷產(chǎn)生，并經(jīng)過鈣化形成骨質(zhì)，成骨細胞被包埋在其中胞內(nèi)活動停止，胞漿減少，胞體變形，轉(zhuǎn)變?yōu)楣羌毎?。成骨細胞的分離培養(yǎng)方法主要有組織塊法和酶消化法，主要取材部位為新生鼠長骨及顱骨。體外分離培養(yǎng)成骨細胞是研究其生物學(xué)特性與功能調(diào)節(jié)的重要工具。

成骨細胞的培養(yǎng)至今大約有40余年的歷史，最初是Peck等于1964年使用膠原酶消化首次成功分離新生大鼠成骨細胞，1975年采用多次膠原酶消化法純化得到的成骨細胞。20世紀80年代，低鈣培養(yǎng)骨片獲得人成骨細胞。有研究證實骨組織中各類細胞耐受消化酶能力依次為：成纖維細胞<破骨細胞<骨祖細胞<成骨細胞。有實驗將分別使用組織塊法及兩種不同的酶消化法共3種方法分離獲取成骨細胞，探索出分離率高、耗時短、成活性好、操作方便的成骨細胞分離方法。為臨床骨相關(guān)疾病治療、骨生物學(xué)特性研究提供穩(wěn)定高效的成骨細胞體外分離方法。

原來培養(yǎng)^[2]

1）組織塊法取大鼠成骨細胞：將新生SD大鼠(72h內(nèi))5只浸泡在體積分數(shù)75%乙醇燒杯中3-5min，無菌條件下剪開頭部皮膚，取出顱骨，放入盛有D-Hanks(含青霉素3×105U/L、鏈霉素3×105U/L)緩沖液的培養(yǎng)皿中，刮去骨膜及骨縫間結(jié)締組織，剪成約1mm×1mm大小的骨片，以D-Hanks液洗3次，加入等量0.25%胰蛋白酶消化10min，加入含體積分數(shù)10%新生小牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化，然后將碎骨片均勻接種于培養(yǎng)瓶中，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶置于培養(yǎng)箱中，3h后轉(zhuǎn)正培養(yǎng)瓶。21d后換液，細胞長滿瓶后傳代培養(yǎng)。

2）膠原酶消化法：取新生SD大鼠(72h內(nèi))5只，即SD乳鼠浸泡于體積分數(shù)75%乙醇的燒杯中消毒3-5min，無菌條件下剪開頭部皮膚，取出顱骨，放入盛有D-Hanks(含青霉素3×105U/L、鏈霉素3×105U/L)緩沖液的培養(yǎng)皿中，刮去骨膜及骨縫間結(jié)締組織，剪成約0.5mm×0.5mm大小的骨片，以D-Hanks液洗3次，加入等量0.25%胰蛋白酶消化10min，棄掉胰酶，加入消化液10只/2.5mL(Ⅰ型膠原酶5mg、透明質(zhì)酸酶2.5mg，DMEM培養(yǎng)液配制)，37℃恒溫條件消化20min，每5min搖勻1次，讓消化液與骨片充分接觸。吸走棄掉消化液，再加入2.5mL消化液在37℃恒溫條件下消化90min。用等量含血清培養(yǎng)液終止消化，將消化液轉(zhuǎn)移至離心管中。用培養(yǎng)液將骨塊洗3次，吹打骨塊，同樣轉(zhuǎn)移液體到離心管中。離心1000r/min，6min沉淀細胞，含血清培養(yǎng)液重懸細胞，放入體積分數(shù)5%CO2飽和濕度條件下于恒溫培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)。差速貼壁法純化成骨細胞，待細胞長滿瓶底傳代培養(yǎng)。

3）分段膠原酶消化法：取新生大鼠(72h內(nèi))5只，即SD乳鼠浸泡于體積分數(shù)75%乙醇的燒杯中消毒3-5min，無菌條件下剪開頭部皮膚，取出顱骨，放入盛有D-Hanks(含青霉素3×105U/L、鏈霉素3×105U/L)緩沖液的培養(yǎng)皿中，刮去骨膜及骨縫間結(jié)締組織，剪成約0.5mm×0.5mm大小的骨片，以D-Hanks液洗3次，加入等量0.25%胰蛋白酶消化10min，棄掉胰酶，加入消化液10只/2.5mL(Ⅰ型膠原酶5mg、透明質(zhì)酸酶2.5mg，DMEM配制)，37℃恒溫條件消化20min，每5min搖勻1次，讓消化液與骨片充分接觸。吸走棄掉消化液。再加入2.5mL消化液。37℃恒溫條件消化20min，收集細胞懸液，離心1000r/min，5min沉淀細胞，將上清轉(zhuǎn)移至骨片繼續(xù)消化重復(fù)6個循環(huán)。每次沉淀的細胞都要用含血清培養(yǎng)液重懸。最后將所有細胞懸液收集離心，含血清培養(yǎng)液重懸，放入體積分數(shù)5%CO2飽和濕度條件下于恒溫培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)，差速貼壁法純化成骨細胞，待細胞長滿瓶底傳代培養(yǎng)。

4）結(jié)果：酶消化分離所得細胞接種于培養(yǎng)瓶，24h后細胞充分伸展，呈梭形、三角形或不規(guī)則多邊形。植塊法細胞圍繞骨片生長，細胞呈長梭型。培養(yǎng)2d后，膠原酶消化法獲取的成骨細胞呈現(xiàn)多邊形并有長突起，見圖1；組織塊法獲取的成骨細胞呈現(xiàn)長梭狀并有長突起，見圖2。分離細胞皆有成骨細胞典型特征。

主要參考資料

[1] 新編實用醫(yī)學(xué)詞典

[2] 新生大鼠成骨細胞原代培養(yǎng)與鑒定