背景及概述^[1]

軟骨細胞是軟骨組織中的主要細胞成分。位于軟骨陷窩中。軟骨細胞的核小，呈圓形或橢圓形，有1至數個核仁，胞質略嗜堿性。細胞形狀依軟骨組織而異：在透明軟骨，靠近軟骨膜的細胞呈橢圓形，其長軸與軟骨表面平行，深部的細胞逐漸變?yōu)閳A形或卵圓形，常常兩個或多個聚集成群，稱為同源細胞群；在彈性軟骨，細胞的形態(tài)基本上與透明軟骨的相似；在纖維軟骨，細胞略呈卵圓形，夾在膠原纖維束之間，單個存在、成對存在或排列成單行。大鼠關節(jié)軟骨細胞分離自卵巢組織；卵巢是雌性動物的生殖器官，卵巢的功能是產生卵以及類固醇激素。卵巢的位置與睪丸相同，僅左側發(fā)育（右側已退化），呈葡萄狀，均為處于不同發(fā)育時期的卵泡，卵泡呈黃色，卵巢表面密布血管。卵巢的大小與年齡和產卵期有關。

大多數脊椎動物有兩個卵巢，但是部分魚類的兩個卵巢融合為單個結構，而所有鳥類只有左側卵巢有機能。卵巢是位于子宮兩側的一對卵圓形的生殖器官，它的外表有一層上皮組織，其下方有薄層的結締組織。卵巢的內部結構可分為皮質和髓質。皮質位于卵巢的周圍部分，主要由卵泡和結締組織構成；髓質位于中央，由疏松結締組織構成，其中有許多血管、淋巴管和神經。卵巢顆粒細胞是卵巢的主要功能細胞，其增殖與分化直接影響著卵泡的生長啟動、發(fā)育、排卵、黃體形成以及甾體激素分泌等卵巢功能活動。卵巢顆粒細胞是卵泡內的細胞群，也是主要的功能細胞，卵泡發(fā)育的顯著標志就是顆粒細胞迅速生長及增殖，而成年動物的卵泡閉鎖主要是由顆粒細胞凋亡引起，尤其在卵泡發(fā)育后期，此外，顆粒細胞還與卵泡膜細胞共同完成卵巢激素的合成，維持著有利于卵母細胞生長和成熟的微環(huán)境。細胞形狀呈圓形或橢圓形。

制備^[1]

1）大鼠關節(jié)軟骨細胞的取材、培養(yǎng)及細胞一般生物活性測定

取4～5周齡，體重185～200g的SD大鼠，斷頸處死，置于5%CO2混和氣體環(huán)境中，37℃恒溫箱內單層培養(yǎng)，隔3d首次換液，8～10d達85%融合后進行傳代。以臺盼藍染色法計算細胞活性。活性細胞獲得率(個/g)=細胞總數/軟骨消化量。細胞存活率(%)=活性細胞總數/(活性細胞總數+死細胞總數)×100%。細胞貼壁率(%)=(接種細胞總數-漂浮細胞數)×100%。軟骨細胞群體倍增時間(doubblingtimeDT)的測定：DT=(t-t0)log2/(logn-logn0)。接種時培養(yǎng)時間t0，細胞計數為n0；收集時培養(yǎng)時間為t，細胞計數為n。

2）倒置相差顯微鏡下形態(tài)學觀察

取每代貼壁軟骨細胞于倒置相差顯微鏡觀察細胞生長情況。倒置相差顯微鏡觀察：原代軟骨細胞9～12h部分貼壁，大部分在24h時完成貼壁，部分細胞開始伸展，細胞體積較小，呈多角形，均勻散在生長，48h內基本上鋪展成三角或多角形；7～10d達到90%融合形成單層細胞，細胞仍呈多角形或短梭形，細胞排列緊密，折光性強。傳代細胞貼壁時間為2～4h，第1～2代細胞生長旺盛，3～4d細胞即可融合，細胞呈多角形小部分細胞形態(tài)狹長。第3代細胞形態(tài)逐漸變狹長，折光性減弱。第5代以后，均呈長梭型老化。8、9代后細胞梭狀鋪平，鏡下長而大，折光差，部分細胞脫落，形態(tài)不規(guī)則。見圖1。

3）軟骨細胞透射電鏡觀察胰酶消化各代次軟骨細胞，離心后先于離心管培養(yǎng)3d，送福建醫(yī)大電鏡室制片觀察。經離心管培養(yǎng)3d后，固定標本進行電鏡技術觀察，原代P0培養(yǎng)軟骨細胞為卵圓形或圓形，細胞核清晰，較多異染色質分布于核膜邊緣和核內。胞漿內有較多糖原顆粒和分泌囊泡，胞漿內含有豐富的內質網和高爾基體。細胞周圍和細胞間可見網絡樣結構及少量膠原纖維和蛋白聚糖，但是結構較稀疏，排列較亂，缺乏緊密的膠原網絡結構。傳代后P1軟骨細胞體積逐漸增大，胞漿內細胞器減少。細胞外膠原纖維增粗，量變少，蛋白聚糖進一步減少，末發(fā)現凋亡軟骨細胞。P2代軟骨細胞為三角形或卵圓形，細胞核及核仁清晰，少許異染色質沿核膜均勻分布，核內以常染色質為主。胞漿內有較多糖原顆粒和分泌囊泡，內質網和線粒體較豐富。見圖2。

4）MTT法描繪生長曲線

按照上海申能博采公司MTT使用說明書進行實驗，以時間為橫軸，光吸收值為縱軸繪制細胞生長曲線。1～2dP2代軟骨細胞增殖緩慢，2～3d快速增殖，3～4d趨于平緩，4～6d呈下降趨勢。

主要參考資料

[1] 獸醫(yī)大辭典

[2] 大鼠關節(jié)軟骨細胞的分離、培養(yǎng)與鑒定