背景及概述^[1]

大鼠結(jié)腸平滑肌細(xì)胞分離自結(jié)腸組織；結(jié)腸在右髂窩內(nèi)續(xù)于盲腸，在第3骶椎平面連接直腸。結(jié)腸分升結(jié)腸、橫結(jié)腸、降結(jié)腸和乙狀結(jié)腸4部分，大部分固定于腹后壁，結(jié)腸的排列酷似英文字母“M”，將小腸包圍在內(nèi)。結(jié)腸橫切面由內(nèi)到外依次為：黏膜（上皮層、固有層、黏膜肌層），黏膜下層（疏松結(jié)締組織），肌層（內(nèi)環(huán)形、外縱行兩層平滑?。饽ぃɡw維膜或漿膜）。大鼠結(jié)腸平滑肌細(xì)胞主要分布于黏膜肌層和肌層的內(nèi)環(huán)形、外縱行平滑??；結(jié)腸運(yùn)動少而緩慢，對刺激的反應(yīng)也較遲緩。結(jié)腸平滑肌在食物消化與吸收、腸道運(yùn)動和物質(zhì)分泌、誘發(fā)全身炎癥反應(yīng)以及細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑等研究中起著重要的作用。大鼠結(jié)腸平滑肌細(xì)胞原代分離培養(yǎng)3天后，可見細(xì)胞貼壁伸展，細(xì)胞形態(tài)大小不一，呈梭形、不規(guī)則形、三角形或扇形，核卵圓形、居中；2周后細(xì)胞匯合，多數(shù)細(xì)胞伸展呈長梭形，胞漿豐富，有分枝狀突起，細(xì)胞平行排列成單層或部分區(qū)域多層重疊生長，高低起伏；細(xì)胞密度低時，常交織成網(wǎng)狀；密度高時，則排列為旋渦狀或柵欄狀。傳代后細(xì)胞生長較快，4-6天即可匯合，并保持上述形態(tài)學(xué)特征和生長特點(diǎn)。結(jié)腸平滑肌運(yùn)動活性受到神經(jīng)遞質(zhì)、胃腸激素和藥物等因素的調(diào)節(jié)。隨著現(xiàn)代胃腸動力學(xué)研究的進(jìn)展，對胃腸運(yùn)動的研究已從器官、組織水平發(fā)展到細(xì)胞、分子水平，要求在胃腸道單個平滑肌細(xì)胞標(biāo)本上來完成各種電生理、藥理和分子生物學(xué)等實(shí)驗(yàn)。體外培養(yǎng)細(xì)胞，由于影響因素單一，是研究細(xì)胞功能以及相應(yīng)的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的基礎(chǔ)。

制備^[1]

1)單個大鼠結(jié)腸平滑肌細(xì)胞的分離

參照Bitar法加以改進(jìn)，Wistar大鼠，180~220g，雌雄不限，實(shí)驗(yàn)前禁食24h，自由飲水。頸椎脫臼處死，剖開腹腔，快速自肛門上2cm取結(jié)腸約10cm，并放置在4℃無鈣臺氏液中，沖洗結(jié)腸內(nèi)殘余糞便。將沖洗干凈的腸段移入含無鈣臺氏液的塑料培養(yǎng)板中，體視顯微鏡下采用機(jī)械法小心的刮除黏膜層、黏膜下層及漿膜層，將較純的平滑肌組織層剪成1~2mm3的碎塊，加入到消化液中，37℃恒溫水浴震蕩20min，200g/min離心5min，棄消化液。再加入10ml消化液，37℃恒溫水浴震蕩20min，加2倍無鈣臺氏液中止消化，用玻璃吸管柔和吹打3min，使細(xì)胞自由脫落，尼龍網(wǎng)過篩(孔徑500μm)，離心，棄上清，加適量KB液懸浮細(xì)胞，4℃冰箱儲存待用，電生理實(shí)驗(yàn)一般在8h內(nèi)使用。

2）細(xì)胞形態(tài)觀察　

單個大鼠結(jié)腸平滑肌細(xì)胞在KB液中保存1h后，離心，采用梯度復(fù)鈣法，使細(xì)胞外Ca2+終濃度恢復(fù)至1mmol/L后，取一滴細(xì)胞懸液置于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。光鏡下觀察，細(xì)胞呈梭形，橫紋清晰，遮光性較強(qiáng)，長度各異，有的舒張，有的收縮，細(xì)胞成活率90%左右(圖1a)，細(xì)胞外Ca2+濃度恢復(fù)至1mmol/L后，細(xì)胞仍能保持長梭形，細(xì)胞邊緣清晰，有光澤(圖1b)。經(jīng)臺盼藍(lán)染色，80%以上的長梭狀平滑肌細(xì)胞不染色并保持正常形態(tài)，提示細(xì)胞成活率達(dá)80%。

3）細(xì)胞活性檢測　

0.4%臺盼藍(lán)溶液與細(xì)胞懸液1∶1混合，室溫放置3~5min，取20μl細(xì)胞懸液置于血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，高倍鏡下觀察細(xì)胞存活狀況。死細(xì)胞染成淡藍(lán)色，而活細(xì)胞不染色并保持正常形態(tài)。

4）細(xì)胞鈣電流記錄　

細(xì)胞池中預(yù)先沖入鈣電流細(xì)胞外液，取已復(fù)鈣的細(xì)胞懸液加入細(xì)胞池中，靜止10min使細(xì)胞貼壁。將充灌電極內(nèi)液的玻璃微電極與細(xì)胞膜接觸，給予輕微負(fù)壓開始封接，當(dāng)封接電阻大于1GΩ后即形成高阻封接，破膜，形成全細(xì)胞模式，采用Axopatch200B放大器(AXON公司)記錄細(xì)胞膜鈣電流。電極尖端電阻以2~6MΩ為宜。

5）鈣電流數(shù)據(jù)采用Clampfit10軟件進(jìn)行分析，并通過Sigmaplot軟件進(jìn)行作圖及曲線擬合。

A：-80mV鉗制電壓鉗制細(xì)胞，給予10ms的快速刺激，使快鈉通道失活，再給予-40mV的鉗制電壓，從-40mV開始，以10mV的階躍刺激連續(xù)去極化至+50mV，持續(xù)500ms，刺激頻率0.5Hz，記錄細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)激活電流(圖2a)。

B：ICa-L電流-電壓(I-V)曲線：大鼠結(jié)腸平滑肌細(xì)胞激活電壓為-10mV，反轉(zhuǎn)電位為33mV(圖2b)

C：采用雙脈沖刺激，保持電壓-80mV，先給予條件脈沖從-90mV，每隔10mV連續(xù)去極化至0mV，持續(xù)300ms，然后至-40mV，間期1ms，再跟一固定的去極化至0mV，持續(xù)140ms的測試脈沖。記錄細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)失活曲線(圖2c)。

D：采用雙脈沖刺激，保持電壓-40mV，先給予去極化至0mV，持續(xù)260ms的條件脈沖，再給一同樣的刺激脈沖，兩脈沖的間隔時間從0~1s逐漸增加，每次75ms。記錄細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)失活曲線(圖2d)。

主要參考資料

[1] 新編實(shí)用醫(yī)學(xué)詞典

[2] 大鼠結(jié)腸平滑肌細(xì)胞分離及電生理功能鑒定