高效液相色譜法(HPLC)是藥品質(zhì)量控制中應(yīng)用非常廣泛的一種儀器分析手段，可用于化合物的定性和定量分析，但由于溶解樣品所用的溶劑與流經(jīng)色譜系統(tǒng)的流動(dòng)相經(jīng)常不一致，有時(shí)會(huì)產(chǎn)生溶劑效應(yīng)，引起峰形畸變、保留漂移、分離變差等現(xiàn)象，嚴(yán)重影響HPLC定性和定量分析的準(zhǔn)確性。
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我司在用HPLC檢測硫酸艾沙康唑雜質(zhì)RM-I192220 (Isavuconazole Impurity 20/BAL19714; CAS No: 2733698-17-2)時(shí)觀察到由溶劑引起的峰形畸變現(xiàn)象，因此進(jìn)一步研究了溶劑與峰形畸變之間的漸進(jìn)關(guān)系，積累數(shù)據(jù)以供參考，便于在HPLC檢測中出現(xiàn)類似情況時(shí)對比分析原因并糾正，避免誤判結(jié)果。
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一、研發(fā)背景：紅外數(shù)據(jù)異常
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2021年12月，硫酸艾沙康唑膠囊獲得國家藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)上市，批準(zhǔn)適應(yīng)癥為：用于治療成人侵襲性曲霉病和毛霉菌病，成為我國首個(gè)獲批用于治療成人侵襲性毛霉病的口服抗真菌藥。
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目前各國藥典均未收錄該藥品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，國內(nèi)僅有進(jìn)口藥品注冊標(biāo)準(zhǔn)，RM-I192220為硫酸艾沙康唑膠囊、注射液注冊標(biāo)準(zhǔn)中均有控制的雜質(zhì)BAL19714，其標(biāo)準(zhǔn)相對保留時(shí)間(RRT)為0.36，出峰較早，相對更容易受溶劑效應(yīng)影響，在檢測中我們觀察到該雜質(zhì)峰的色譜行為，與溶劑中有機(jī)相的比例存在一定關(guān)系。因此我們進(jìn)行了相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究，其主要內(nèi)容為用不同比例的乙腈溶解雜質(zhì)BAL19714后，考察溶劑中乙腈比例、進(jìn)樣量與峰形的關(guān)系。
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圖1:雜質(zhì)BAL19714結(jié)構(gòu)
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二、結(jié)果討論
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1、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
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儀器：Thermo U3000高效液相色譜儀
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色譜條件：硫酸艾沙康唑制劑注冊標(biāo)準(zhǔn)的有關(guān)物質(zhì)方法
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樣品溶液：
樣品溶液1（8mg/ml，溶劑15%乙腈）
樣品溶液2（1mg/ml，溶劑15%乙腈）
樣品溶液3（1mg/ml，溶劑25%乙腈）
樣品溶液4（1mg/ml，溶劑50%乙腈）
實(shí)驗(yàn)方案
分別考察單因素變量：
(1)溶劑中乙腈比例 （2)雜質(zhì)溶液濃度 （3)進(jìn)樣體積對色譜峰形的影響。
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2、圖譜數(shù)據(jù)
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（1）單因素變量-溶劑中乙腈比例
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圖2:單因素變量-溶劑中乙腈比例-對比圖
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??數(shù)據(jù)分析：分別用15%、25%、50%的乙腈作為溶劑，配置相同濃度的雜質(zhì)溶液、各進(jìn)樣50μl。發(fā)現(xiàn)以15%的乙腈作為溶劑不易引起峰形畸變，為其中最優(yōu)選的溶劑。
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（2）單因素變量-雜質(zhì)溶液濃度
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圖3:單因素變量-雜質(zhì)溶液濃度-對比圖
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??數(shù)據(jù)分析：以15%乙腈作為溶劑，分別配制1mg/ml、8mg/ml的雜質(zhì)溶液，各進(jìn)樣20μl。1mg/ml的雜質(zhì)溶液主峰峰高約為300m AU，0.05%（該注冊標(biāo)準(zhǔn)忽略限）倍主峰峰高僅為0.15m AU，考慮到儀器靈敏度，8mg/ml為其中更優(yōu)選的純度檢測溶液濃度.
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（3）單因素變量-進(jìn)樣體積
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圖4：單因素變量-進(jìn)樣體積（溶劑15%乙腈）-對比圖
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??數(shù)據(jù)分析：以15%乙腈作為溶劑，配制1mg/ml的雜質(zhì)溶液，分別進(jìn)樣20、50、70、100μl。當(dāng)進(jìn)樣量達(dá)到70μl時(shí)，峰形開始發(fā)生畸變。
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圖5：單因素變量-進(jìn)樣體積（溶劑25%乙腈）-對比圖
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??數(shù)據(jù)分析：以25%乙腈作為溶劑，配制1mg/ml的雜質(zhì)溶液，分別進(jìn)樣20、50、70、100μl。當(dāng)進(jìn)樣量達(dá)到50μl時(shí)，峰形開始發(fā)生畸變。
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圖6：單因素變量-進(jìn)樣體積（溶劑50%乙腈）-對比圖
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??數(shù)據(jù)分析：以50%乙腈作為溶劑，配制1mg/ml的雜質(zhì)溶液，分別進(jìn)樣10、20、30、50。當(dāng)進(jìn)樣量達(dá)到20μl時(shí)，峰形開始發(fā)生畸變。
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圖7：溶劑中乙腈量與峰畸變關(guān)系-對比圖
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綜上，當(dāng)注入色譜系統(tǒng)的樣品溶液中乙腈量達(dá)到10μl，主峰前檢出的雜質(zhì)小峰開始展寬，并隨乙腈量增加逐漸裂分；當(dāng)乙腈量達(dá)到15μl，主峰開始畸變；當(dāng)乙腈量達(dá)到20μl，主峰因被大幅度提前洗脫而裂分為多個(gè)峰，如圖7。因此，溶劑中乙腈比例建議不高于25%，此時(shí)20μl為最優(yōu)選的進(jìn)樣體積。
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3、結(jié)論
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該注冊標(biāo)準(zhǔn)有關(guān)物質(zhì)檢測方法的梯度程序初始有機(jī)相比例為2.5%，樣品溶劑中乙腈的比例為15%，進(jìn)樣量為20μl，由本次試驗(yàn)考察結(jié)果來看，該方法的參數(shù)設(shè)置合理。
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該方法的梯度初始有機(jī)相比例僅為2.5%，在這樣一個(gè)有機(jī)相比例較低的流動(dòng)相體系下，注入過多強(qiáng)洗脫能力的溶劑，會(huì)使樣品中的組分被提前洗脫而引起色譜峰畸變，尤其是出峰較早的組分更容易受到影響。溶劑的洗脫能力越強(qiáng)，色譜峰畸變越明顯，存在漸進(jìn)的關(guān)系。
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三、經(jīng)驗(yàn)總結(jié)
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注入樣品溶液可以視為對色譜系統(tǒng)流動(dòng)相的一次短暫性改變，盡管為了避免打破平衡狀態(tài)，應(yīng)盡可能選擇與流動(dòng)相洗脫能力接近的溶劑溶解樣品。但綜合考慮樣品溶解性、溶液穩(wěn)定性等原因，仍然不可避免使用較強(qiáng)洗脫能力的溶劑。
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TIPS |?建議
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1、盡量選擇與流動(dòng)相接近的溶劑，如直接使用流動(dòng)相作為溶劑，或有機(jī)相比例與流動(dòng)相接近、更低的溶劑，通常有機(jī)相比例更低的溶劑帶來的負(fù)面影響較小。
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2、如采用有機(jī)相比例更高的溶劑，可通過減少進(jìn)樣量來消除溶劑效應(yīng)，但還需考慮進(jìn)樣后溶質(zhì)是否會(huì)在流動(dòng)相中析出，這時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)滯后出峰而拖尾的情況。
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3、如出現(xiàn)異常的色譜峰形，可以通過減少進(jìn)樣量、降低有機(jī)相比例來考察是否為溶劑效應(yīng)影響。
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4、可在色譜柱前加裝溶劑效應(yīng)消除器或增加管路，使進(jìn)樣的組分更充分?jǐn)U散到流動(dòng)相中，可以一定程度上消除溶劑效應(yīng)。
