穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建的基本原理與實(shí)驗(yàn)步驟
一、基本概念
細(xì)胞株（Cell Strain）是指通過(guò)選擇法或克隆形成法，從原代培養(yǎng)物或細(xì)胞系中篩選獲得的、具有特定性質(zhì)或標(biāo)志物的培養(yǎng)細(xì)胞群體。細(xì)胞株在培養(yǎng)過(guò)程中需保持其特殊性質(zhì)或標(biāo)志物的穩(wěn)定表達(dá)。對(duì)于人類腫瘤細(xì)胞而言，體外培養(yǎng)半年以上、生長(zhǎng)狀態(tài)穩(wěn)定并能連續(xù)傳代的細(xì)胞群體，即可稱為連續(xù)性細(xì)胞株或細(xì)胞系。
穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株（Stable Cell Line）的構(gòu)建原理為：將外源目的基因克隆至帶有特定抗性篩選標(biāo)記的表達(dá)載體中，通過(guò)轉(zhuǎn)染或病毒感染將載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞。外源DNA整合到宿主染色體后，利用載體攜帶的抗性標(biāo)志物進(jìn)行藥物篩選，最終獲得能夠穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白或穩(wěn)定沉默特定基因的細(xì)胞株。
A549肺癌穩(wěn)轉(zhuǎn)株
二、常用抗性篩選標(biāo)志物
真核表達(dá)載體中最常用的抗性篩選標(biāo)志物包括：
新霉素（Neomycin）：對(duì)應(yīng)篩選藥物為G418
潮霉素（Hygromycin）
嘌呤霉素（Puromycin）
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三、穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的主要應(yīng)用
l 長(zhǎng)期基因功能研究：構(gòu)建穩(wěn)定株可顯著降低頻繁轉(zhuǎn)染或病毒包裝的成本，便于開展長(zhǎng)期、系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)研究。
l 高效基因沉默：部分蛋白半衰期極長(zhǎng)，瞬時(shí)RNA干擾僅能抑制新蛋白的合成，無(wú)法清除已表達(dá)的目的蛋白。構(gòu)建穩(wěn)定株可實(shí)現(xiàn)更徹底的基因沉默效果。
l 精確調(diào)控表達(dá)水平：瞬時(shí)轉(zhuǎn)染常導(dǎo)致不可預(yù)期的拷貝數(shù)和高表達(dá)水平，易因人為因素引入實(shí)驗(yàn)偏差。構(gòu)建穩(wěn)定株有助于篩選拷貝數(shù)適中、表達(dá)水平均一的細(xì)胞群體，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。
l 誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)：穩(wěn)定株可用于構(gòu)建可誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)基因的時(shí)空特異性調(diào)控。
l 動(dòng)物模型構(gòu)建：需要利用目的細(xì)胞構(gòu)建體內(nèi)動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)，通常必須以穩(wěn)定株為基礎(chǔ)。
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四、慢病毒構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的優(yōu)勢(shì)
慢病毒（Lentivirus）具有廣泛的宿主細(xì)胞嗜性，幾乎可感染所有類型的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。感染后，慢病毒基因組可整合至宿主細(xì)胞染色體中，實(shí)現(xiàn)外源基因的長(zhǎng)期、穩(wěn)定表達(dá)。因此，慢病毒是制備穩(wěn)定表達(dá)或穩(wěn)定沉默特定基因的單克隆細(xì)胞株的首選工具。
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五、慢病毒構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的標(biāo)準(zhǔn)流程
1. 確定目的細(xì)胞的最適抗生素篩選濃度（殺傷曲線測(cè)定）；
2. 確定目的細(xì)胞的最適病毒感染滴度（MOI優(yōu)化）；
3. 慢病毒載體的構(gòu)建、包裝與滴度測(cè)定；
4. 慢病毒感染目的細(xì)胞；
5. 抗生素篩選獲得穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株；
6. 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的鑒定與驗(yàn)證（包括基因水平、蛋白水平及功能水平）。
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