近年來，多重免疫熒光（Multiplex Immunohistochemistry，mIHC）憑借其多標志物同步檢測和空間信息分析能力，已成為腫瘤微環(huán)境研究、免疫治療評估和空間病理學(xué)研究的重要工具。然而，與傳統(tǒng)IHC相比，mIHC實驗流程更加復(fù)雜。從抗體篩選到Panel設(shè)計，再到TSA染色和圖像分析，每一個環(huán)節(jié)都可能影響最終結(jié)果。
本文將帶您快速了解TSA-mIHC實驗流程，并盤點實驗中最常見的問題及解決思路。
Step 1 組織切片制備
目前mIHC最常使用的是FFPE（福爾馬林固定石蠟包埋）組織樣本。組織切片厚度通?？刂圃?-5 μm。
烤片：之后用細毛刷輕柔地將切片從切片刀上分離，隨后置于 40℃ 溫水中使其充分展平，最后在 60℃ 條件下烘烤 2 h以增強切片附著力。60℃烤片1h，確保組織牢固附著于載玻片。
注意事項
? 使用防脫載玻片
? 避免組織折疊
? 新鮮切片優(yōu)于長期保存切片
Step 2 脫蠟與復(fù)水
目的： 去除石蠟并逐步恢復(fù)組織水化狀態(tài)，為后續(xù)抗原修復(fù)做好準備。
常見流程：二甲苯Ⅰ（10 min） → 二甲苯Ⅱ（10 min） → 無水乙醇（5 min） → 95%乙醇（5 min） → 85%乙醇（5 min） → 75%乙醇（5 min） → 蒸餾水洗滌
常見問題：組織邊緣脫落
可能原因：
? ? ????烤片不足
? ? ????脫蠟時間過長
? ? ????載玻片附著力不足
Step 3 抗原修復(fù)
福爾馬林固定會導(dǎo)致蛋白交聯(lián)，掩蓋抗原表位，因此必須進行抗原修復(fù)。
熱誘導(dǎo)抗原修復(fù)是最常用的方法，常見緩沖液有：檸檬酸緩沖液（pH 6.0）和EDTA緩沖液（pH 8.0-9.0）。EDTA 緩沖液可以在檸檬酸緩沖液使用效果不好時使用，但需注意在高表達樣本中可能產(chǎn)生非特異性染色?？梢远鄧L試幾種修復(fù)方法以達到最佳染色效果。
微波修復(fù)：加入抗原修復(fù)液，放入切片，置于微波爐中火 8 min，?；?7 min，轉(zhuǎn)小火 8 min；取出染色盒，冷卻至室溫。
水浴修復(fù)：加入抗原修復(fù)液，放入切片，置于水浴鍋中 95℃ 恒溫 25-30 min (注意控制溫度避免沸騰，以防組織脫落)。將樣片與水共冷，不可驟冷，避免快速降溫導(dǎo)致抗原表位構(gòu)象改變。
高壓修復(fù)：在染色盒中加入抗原修復(fù)液，放入切片，置于高壓鍋內(nèi)加熱至飽壓后繼續(xù)加熱 5 min，關(guān)閉電源，10 min 后取出染色盒，冷卻至室溫。
酶解修復(fù)：常用的消化酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶 K 等。將切片置于含有酶解液的載玻片上，然后在適當?shù)臏囟群蜐穸葪l件下進行酶解 (通常為 37°C，20 min)。酶解后，同樣需要冷卻切片至室溫再進行后續(xù)處理。修復(fù)后用 PBS 在搖床上洗 3 遍，每次 5 min。
注意事項
??不同抗體最佳修復(fù)條件可能完全不同。
??建議先完成單染驗證。
Step 4 阻斷
采用 3% H?O? 溶液室溫避光孵育樣本 20 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，避免其對后續(xù) HRP 顯色系統(tǒng)的干擾。
洗滌：用 ddH?O 清洗切片兩次，每次 5 min。用 PBS 在搖床上洗 1 遍，每次 5 min。
Step 5 封閉
用組化筆圈出玻片上的樣本區(qū)域，滴加封閉液，降低非特異性結(jié)合背景。37℃ 孵育 30 min。
常用試劑：
? ? ????3% H?O?（封閉內(nèi)源性過氧化物酶）
? ? ????正常山羊血清
? ? ????BSA封閉液
洗滌：用 PBS 在搖床上洗 3 遍，每次 5 min。
Step 6 一抗孵育
選擇合適的一抗，并用稀釋液 (PBS、TBS 等) 稀釋一抗至合適的比例。使用移液器將稀釋后的一抗均勻覆蓋樣本區(qū)域，置于濕度平衡的孵育盒中，37℃ 恒溫孵育1h或4℃過夜。建議：優(yōu)先使用經(jīng)過IHC驗證的抗體。
洗滌：用 PBS 在搖床上洗 3 遍，每次 5 min。針對易脫片樣本，采用 37℃ 預(yù)溫的溫和洗脫緩沖液，輕柔洗滌 5-20 分鐘，以維持組織完整性同時有效去除非特異性結(jié)合。
抗體選擇原則
? 定位明確
? 特異性良好
? 文獻支持充分
? FFPE驗證通過
Step 7 HRP二抗孵育
選擇合適的HRP標記二抗，并用稀釋液 (PBS、TBS 等) 稀釋二抗至合適的比例。37℃ 恒溫孵育1h，注意避光和干片。
洗滌：用 PBS 在搖床上洗 3 遍，每次 5 min。
Step 8 TSA熒光沉積
這是TSA-mIHC最關(guān)鍵的一步。
在玻片上滴加 100 μL 染色工作液，浸沒樣本，37℃孵育30min。HRP催化熒光標記的酪胺（Tyramide）分子將沉積于抗原周圍。形成共價結(jié)合熒光信號。
洗滌：用 PBS 在搖床上洗 3 遍，每次 5 min。
特點：
? 高靈敏度
? 信號放大
? 后續(xù)修復(fù)不易丟失
Step 9 抗體剝離
在組織上滴加抗體洗脫液，37℃孵育15min。
目的：去除當前輪次抗體，保留已經(jīng)沉積的熒光信號，這樣即可進行下一輪染色。
Step 10 多輪重復(fù)染色
從 "封閉" 開始，重復(fù)步驟 封閉 → 一抗孵育 → HRP二抗孵育 → TSA熒光沉積 → 抗體剝離。
按照Panel設(shè)計順序完成2-6個標志物，甚至更多標志物檢測。
經(jīng)驗原則：
??高表達抗原優(yōu)先染色
??弱表達抗原后染色
??避免信號覆蓋。
Step 11 DAPI復(fù)染
所有標志物完成后。滴加 DAPI 工作液到樣本上，室溫孵育 5 min，PBS 洗滌3次，，每次 5min。將液體甩干，在組織上滴加抗熒光淬滅封片劑，蓋上蓋玻片。
將做好的熒光切片置于4℃避光保存。
作用：
? 細胞計數(shù)
? 細胞分割
? 空間分析基礎(chǔ)
Step 12 多光譜掃描
切片于熒光顯微鏡/共聚焦/多通道熒光掃描儀/多光譜成像系統(tǒng)下觀察并采集圖像。
通過專業(yè)軟件完成：光譜拆分、細胞分割、表型分析、空間分析等。
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