TurboID是一種工程化的生物素連接酶，它利用ATP將生物素轉(zhuǎn)化為生物素-AMP，這是一種活性中間產(chǎn)物，可共價標記鄰近的蛋白質(zhì)。通過定向進化進行優(yōu)化，TurboID的活性比之前描述的與生物素連接酶相關(guān)的鄰近標記方法（如BioID）高得多，從而能夠?qū)崿F(xiàn)更高的時間分辨率和更廣泛的應(yīng)用。split-TurboID由TurboID的兩個非活性片段組成，它們可以通過蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用或細胞器-細胞器相互作用重新組裝，這有助于提高比單獨的全長酶更高的靶向特異性。通過TurboID或split-TurboID進行生物素化的蛋白質(zhì)隨后用鏈霉親和素珠進行富集，并通過質(zhì)譜法進行鑒定。
2020年11月研究人員在Nat Protoc上發(fā)表了一篇名為“Proximity labeling in mammalian cells with TurboID and split-TurboID”的文章，這是一篇關(guān)于TurboID和split-TurboID在哺乳細胞中鄰近標記的protocal。作者概述如何使用實驗室最新的PL酶TurboID6和split-TurboID進行亞細胞蛋白質(zhì)組學圖譜的繪制。作者詳細描述了如何進行融合結(jié)構(gòu)設(shè)計和表征（可變時間），蛋白質(zhì)組樣品制備（5-7d），質(zhì)譜數(shù)據(jù)獲?。?d）和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)分析（1周）。
TurboID鄰近標記技術(shù)的局限性
不同的亞細胞區(qū)域具有不同的PH，氧化還原環(huán)境，內(nèi)源性核苷酸濃度，導致TurboID的活性存在差異。TurboID的活性差異也因細胞器和生物體類型不同而存在差異；并且它與蛋白融合可能會影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，定位，功能；因此評估擬用于蛋白質(zhì)組學的TurboID融合構(gòu)建體的活性至關(guān)重要。這種分析法可能無法考慮雙重定位的蛋白質(zhì)，導致覆蓋率降低（例如，一種同時存在于ERM和細胞質(zhì)中的蛋白質(zhì)會在使用細胞質(zhì)TurboID作為參考的第二輪篩選步驟中被去除。）
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TurboID蛋白質(zhì)組學實驗的流程概述
進行TurboID蛋白質(zhì)組學實驗的工作流程：設(shè)計的融合構(gòu)建體應(yīng)使用免疫熒光和蛋白質(zhì)印跡法進行表征，并在必要時進行優(yōu)化。在構(gòu)建體驗證之后，在生成用于質(zhì)譜分析的蛋白質(zhì)組樣本之前，需要對富集條件進行優(yōu)化。最后在質(zhì)譜分析后進行數(shù)據(jù)分析已識別富集的蛋白。數(shù)據(jù)分析主要使用比率法結(jié)合基于ROC的閾值分析。
將TurboID定位到目標區(qū)域
首先需要將構(gòu)建體靶向到感興趣的細胞區(qū)域或蛋白質(zhì)復合物。對于細胞器或亞細胞結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)組圖譜繪制，可以通過使用定位序列來實現(xiàn)靶向。使用從細胞色素P450和細胞色素b5衍生的靶向肽將TurboID和split-TurboID靶向到細胞外基質(zhì)ERM并使用從線粒體抗病毒信號蛋白（MAVS）和外膜20千道爾頓亞基轉(zhuǎn)位酶（Tom20）衍生的靶向肽將其靶向到外膜（OMM）。通過免疫染色并與針對相同細胞器的共轉(zhuǎn)染/感染的熒光蛋白標記物進行比較，或者通過與靶向區(qū)域的端源性標記物進行共免疫染色，可以驗證構(gòu)建體的定位。
注意事項：
1）避免通過與全長功能性蛋白融合靶向目標區(qū)域，生物活性蛋白的過度表達可能會干擾信號轉(zhuǎn)導和生物學功能。
2）融合后，可能存在獨特的亞細胞定位，需要在不同水平下測試多個融合構(gòu)建載體，以確保正確的定位，將對目標的干擾降低。
3）TurboID或split-TurboID片段被直接融合到正在研究的誘餌蛋白質(zhì)上。關(guān)鍵是要確保TurboID/split-TurboID片段的融合不會擾亂誘餌蛋白質(zhì)的定位模式、生物功能或相互作用。
4）確保TurboID和split-TurboID不影響連接酶的活性至關(guān)重要。
5）如果構(gòu)建體未與靶向區(qū)域共定位或觀察到大量的細胞器擾動，需要對構(gòu)建體進行優(yōu)化：改變連接子的長度或剛性，構(gòu)建體幾何形狀和靶向序列。通常使用富含甘氨酸和絲氨酸的連接子，起始長度為10個氨基酸。避免使用可能被TurboID標記化學法破壞的FLAG和其他富含賴氨酸的表位標簽。TurboID/split-TurboID融合構(gòu)建體可以通過轉(zhuǎn)染或病毒轉(zhuǎn)導引入哺乳動物細胞。
對TurboID構(gòu)建體的活性進行表征
在驗證融合構(gòu)建體的正確定位和/或功能后，需要評估TurboID/split-TurboID的活性。這可以通過對生物素化蛋白進行免疫熒光染色（例如使用熒光素-親和素偶聯(lián)物）或通過全細胞裂解物中生物素化蛋白的蛋白質(zhì)印跡分析（例如使用鏈霉親和素-熒光素或鏈霉親和素-HRP偶聯(lián)物）來完成。還應(yīng)使用針對相應(yīng)表位標簽的熒光素/HRP抗體偶聯(lián)物對相同的裂解物進行運行和印跡，以驗證TurboID融合構(gòu)建體的表達和完整性（缺乏蛋白水解酶）。大規(guī)模蛋白質(zhì)組實驗前進行小規(guī)模的TurboID/split-TurboID生物素化蛋白的富集，通過銀染法對洗脫物樣本進行分析，以確認實驗樣本中總蛋白的成功富集，并與陰性對照進行比較。
注意事項：
1）包括不含連接酶或生物素的陰性對照，以評估內(nèi)源性生物素化蛋白的信號和背景生物素化水平；
2）使用最低的生物素濃度和最短的標記時間，避免非特異性標記；
3）對各種實驗條件進行優(yōu)化，例如，改變磁珠體積，洗滌次數(shù)，最大化捕獲生物素化物質(zhì)，并同時最小化非特異性結(jié)合到磁珠上；
4）在富集前，使用凝膠過濾柱除去游離的生物素；富集前對內(nèi)源性生物素化蛋白耗竭，可以增加TurboID/split-TurboID標記蛋白的信號。
蛋白質(zhì)組學樣本制備
從小規(guī)模富集中優(yōu)化的條件可以相應(yīng)地擴大規(guī)模，用于大規(guī)模蛋白質(zhì)組學實驗。對于HEK293T細胞中的蛋白質(zhì)組實驗，使用約2000萬個細胞的小瓶來生成用于質(zhì)譜的樣本。使用胰蛋白酶或其他水解酶對在鏈霉親和素珠子進行酶解消化釋放與親和基質(zhì)偶練的蛋白質(zhì)。在去除鏈霉親和素珠子后，釋放的蛋白質(zhì)被完全消化成肽段，通過液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）進行分析?？梢允褂枚喾N定量和半定量方法來區(qū)分實驗條件下的蛋白質(zhì)富集和陰性對照。本實驗的的定量法用的是同位素質(zhì)譜標簽法（TMT）。
注意事項：每種實驗條件需包含重復樣本，包括沒有連接酶或生物素的陰性對照，以及空間特異性對照。例如，在使用TurboID對ERM蛋白的分析中或者使用split-TurboID對ER線粒體接觸蛋白的分析中，同樣使用了包含了TurboID-NES定位于細胞質(zhì)溶膠的樣本以進行比較。
數(shù)據(jù)分析
對于定量方法，需要兩個基于ROC的篩選步驟：首先確定生物素化蛋白質(zhì)；然后確定哪些蛋白質(zhì)優(yōu)先被針對感興趣區(qū)域的TurboID標記。
通過TMT比率繪制的顯示的數(shù)據(jù)集中真陽性蛋白和假陽性蛋白分布的直方圖表明通過ROC確定的截斷值成功地富集了真陽性蛋白。高于確定TMT比率截斷值的蛋白質(zhì)被視為生物素化蛋白，而低于截斷值的蛋白質(zhì)則被視為可能的非特異性結(jié)合物。第二次篩選的目的是比較實驗樣本與針對TurboID的參考對照，該對照針對重疊但不同的亞細胞區(qū)域（它們位于相鄰或連續(xù)的亞細胞區(qū)域）。通過比較實驗樣品與參考樣品（如細胞質(zhì)TurboID-NES）的TMT信號，這一步同樣需要計算TMT比例，分析確定ROC截斷值。進一步過濾蛋白質(zhì)，以確定哪些蛋白質(zhì)在目標區(qū)域中優(yōu)先被生物素化。
注意事項：這2個篩選步驟需要重復進行，并獨立于每個樣本，最終的蛋白質(zhì)組列表是從每個重復樣本的篩選列表的交集生成的。
常見問題與解決方案
作者還總結(jié)了在使用鄰近標記技術(shù)時可能會出現(xiàn)的問題以及相應(yīng)的解決方案。
預期實驗結(jié)果
針對目標的TurboID或分段TurboID融合構(gòu)建體應(yīng)該與適當?shù)臉擞浳锕捕ㄎ?，對于一個成功的蛋白質(zhì)組學實驗，TP蛋白的TMT比率應(yīng)高于FP蛋白，因此ROC圖應(yīng)顯示TPR的增長速度快于FPR。繪制TP和FP蛋白質(zhì)的分布情況也應(yīng)表明所確定的TMT比率閾值成功地富集了TP蛋白質(zhì)。例如，在ERM的蛋白質(zhì)組學圖譜繪制中，使用由最大TPR-FPR定義的閾值，ERM蛋白質(zhì)相對于胞質(zhì)蛋白質(zhì)有明顯的富集。對于映射已知真陽性較少的區(qū)域，如ER-線粒體接觸位點，閾值可通過FDR閾值另行確定。蛋白質(zhì)組學實驗產(chǎn)生的候選蛋白質(zhì)還應(yīng)該使用獨立的方法進行驗證，例如免疫印跡，pull-down，功能實驗以驗證其蛋白相互作用結(jié)果是真實可靠的。
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總結(jié)
這篇文章提供了一個詳細的實驗協(xié)議，使用TurboID和split-TurboID技術(shù)在哺乳動物細胞中進行鄰近標記，以研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用和亞細胞蛋白質(zhì)組學圖譜。通過優(yōu)化的實驗設(shè)計和嚴格的數(shù)據(jù)分析，該技術(shù)能夠高分辨率地揭示活細胞內(nèi)的分子相互作用。文章還討論了實驗中可能遇到的局限性和注意事項，確保了方法的可重復性和結(jié)果的可靠性。這項工作不僅推動了生物醫(yī)學研究的進展，也為疾病機理的探索和新藥開發(fā)提供了新的工具。
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