蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）在生物體功能中發(fā)揮重要作用，參與細胞周期調(diào)控，信號轉導等細胞生物學過程。傳統(tǒng)的分析PPI的檢測方法有免疫共沉淀（Co-IP）、GST，Pull-Down，但是他們的檢測是體外檢測，不能真實反應細胞內(nèi)蛋白質(zhì)之間的相互作用。而新發(fā)展的鄰近標記技術（PL）可直接在自然條件下的活細胞內(nèi)進行，有利于捕獲體內(nèi)瞬時發(fā)生或微弱的蛋白互作關系。在蛋白質(zhì)互作中起作用，在轉錄組、蛋白質(zhì)組空間動態(tài)及組蛋白修飾上，亞細胞定位，藥物靶標的發(fā)現(xiàn)也有重要的應用。鄰近標記（PL）方法與基于質(zhì)譜（MS）的定量蛋白質(zhì)組學相結合已成為表征PPI的有力方法。
鄰近標記技術原理
鄰近標記技術（PL）使用工程化酶，例如過氧化物酶或生物素連接酶，它們在基因上標記到目標蛋白（POI）。PL 酶將惰性小分子底物轉化為短壽命反應性物質(zhì)，它們從酶活性位點擴散出去，共價標記鄰近的內(nèi)源性物質(zhì)。底物分子通常包含一個生物素手柄，以便隨后使用鏈霉親和素珠富集標記物種，并通過質(zhì)譜法（蛋白質(zhì)）或核酸測序（RNA）鑒定它們。
（數(shù)據(jù)來源 Qin W, et al. Nat Methods. 2021.）
鄰近標記方法的類型和發(fā)展
鄰近標記方法主要有兩大類，過氧化物酶標記法（例如APEX，APEX2，Split-APEX2）和生物素標記法（例如BioID、TurboID、miniTurbo、Split-TurboID）。
（數(shù)據(jù)來源 Mathew B, et al. Mol Cell Proteomics. 2022.）
基于生物素連接酶的鄰近標記
BiolD系列的鄰近標記
BiolD：是一種利用大腸桿菌生物素連接酶BirA的變體，分子量為35 kDa，BioID能夠共價標記10nm半徑內(nèi)蛋白質(zhì)上的賴氨酸殘基。鑒于BioID的大分子量阻礙了其在某些融合蛋白中的靶向性，并且需要較長的標記時間。
BioID2：Kim等人在2016年開發(fā)了一種名為BioID2的較小酶，分子量為27 kDa，來源于Aquifex aeolicus。與BioID相比，BioID2具有更高的選擇性靶向融合蛋白，需要較少的補充生物素，并且表現(xiàn)出對鄰近蛋白質(zhì)的增強標記的優(yōu)勢。BioID2不僅提高了蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的篩選效率，而且還允許特異性調(diào)節(jié)生物素標記半徑。
TurboID 系列的鄰近標記
TurboID ：2018年基于酵母展示的BirA定向進化開發(fā)了新的PL酶TurboID（35 kDa），TurboID有15個突變堿基對，使其能夠利用ATP將生物素轉化為生物素-AMP，這是一種反應性中間體，隨后共價標記附近的蛋白質(zhì)。它是生物活性最高的生物素連接酶，它可以利用某些細胞和生物體內(nèi)的內(nèi)源性生物素，在添加外源性生物素之前就顯示出生物素化活性。由于通過酵母分泌途徑進化，TurboID在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中的活性明顯高于BioID。
miniTurbo：miniTurbo也是基于酵母展示的BirA進化開發(fā)的，分子量僅為28kDa，miniTurbo存在N端結構域缺失和13 bp突變。這進一步減少了對融合蛋白轉運和功能的潛在干擾。miniTurbo對生物素的親和力較低，這使得它無法在缺乏高濃度外源生物素的情況下進行標記，從而可以更嚴格地控制標記時間窗。
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基于過氧化物酶的鄰近標記法
HRP：辣根過氧化物酶（HRP）是第一個能夠將芳基疊氮化物生物素試劑轉化為自由基的近距離標記酶。僅在分泌途徑中有活性，如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)管內(nèi)和細胞表面。該方法有利于研究細胞膜結構域的蛋白質(zhì)組成。此外，當與質(zhì)譜分析相結合時，它允許研究細胞表面的分子相互作用。
APEX：APEX是2012年Martell等從二聚豌豆或大豆抗壞血酸過氧化物酶中提取了一種稱新型近距離標記酶。APEX缺乏二硫鍵和鈣結合位點，分子量較?。s28 kD），具有單體功能。APEX靶向細胞內(nèi)的細胞器或特異性蛋白復合物。在H2O2條件下，用生物素-酚處理活細胞僅1分鐘后，APEX催化生物素-酚單電子氧化形成生物素-苯氧基。這種自由基可以與標記半徑內(nèi)的相互作用的酪氨酸殘基或鄰近蛋白質(zhì)的酪氨酸殘基反應形成共價加合物。雖然這些自由基的壽命極短，但它們共價標記了APEX附近的內(nèi)源性蛋白。最近，這項技術在確定人類線粒體基質(zhì)、膜間隙（IMS）蛋白質(zhì)組和線粒體鈣單向轉運體拓撲結構中的蛋白質(zhì)組成方面發(fā)揮了至關重要的作用。
（數(shù)據(jù)來源 Mathew B, et al. Mol Cell Proteomics. 2022）
APEX2：APEX2是將APEX進行定向進化，利用酵母展示平臺和熒光激活細胞分選（FACS）篩選產(chǎn)生的變異體。與APEX相比，它表現(xiàn)出更好的熱穩(wěn)定性和更高的生物素化活性。APEX2應用于電子顯微鏡時也更敏感，使用APEX2，染色可以實現(xiàn)跨大視野，不需要特殊設備。該方法可替代間接測量技術（如亞細胞分離），并可用于蛋白酶可及性測試或蛋白印跡法，以精確確定重要蛋白的亞細胞定位和膜拓撲結構。
基于Split-PL的鄰近標記法
Split-PL系統(tǒng)可用于研究時空定義的二元蛋白復合物和膜接觸位點的其他相互作用成分。PL酶（如HRP、APEX2、BioID或TurboID）被分為兩個相互作用不佳的非功能片段，當與兩種相互作用的蛋白質(zhì)融合時，片段可以重新組裝以恢復活性。
（數(shù)據(jù)來源 Mathew B, et al. Mol Cell Proteomics. 2022）
Split-BioID：Split-BioID的分子量為35 kDa。它能夠驗證蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用，并同時標記屬于活細胞中相應復合物的其他相鄰蛋白質(zhì)，從而彌補親和純化和BioID方法的局限性。split-BioID系統(tǒng)有效地降低了背景生物素化。
Split-TurboID：split-TurboID其分子量為35 kDa。將Split-TurboID作用于FRB-FKBP二聚體體系，rapamycin處理后，TurboID的兩個非活性片段重組形成產(chǎn)生生物素-5 ' -AMP的活性酶。Split-TurboID有低親和力和高親和力兩種形式。在生物素孵育不到1 h的情況下，兩種方法均可催化鄰近性標記，其活性不僅遠高于split-BioID，而且也高于全長BioID。
（數(shù)據(jù)來源 Guo J, et al. Cell Commun Signal. 2023）
Split-APEX2：plit-APEX2方法。該酶分為AP和EX兩部分，AP為從酵母展示文庫中篩選的含200個氨基酸的N端片段，EX為含50個氨基酸的C端片段。Split-APEX2技術已被應用于哺乳動物細胞膜、非編碼RNA支架和線粒體相關內(nèi)質(zhì)網(wǎng)接觸位點。
（數(shù)據(jù)來源 Guo J, et al. Cell Commun Signal. 2023）
鄰近標記技術的應用
蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡分析：利用PL識別單個PPI，破譯不同蛋白的空間關系，構建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡。
亞細胞區(qū)域的蛋白組成分析：用于分析特定亞細胞區(qū)域的蛋白質(zhì)組成，如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細胞核等。
膜接觸位點（MCSs）的研究：有助于研究細胞器之間的相互作用，尤其是在膜接觸位點的蛋白質(zhì)。通過使用PL技術，可以識別和研究這些位點上的蛋白質(zhì)，從而更好地理解細胞內(nèi)通訊和物質(zhì)運輸。
用于測定蛋白質(zhì)的拓撲結構：可以揭示膜蛋白的拓撲結構，幫助理解其在信號傳導和分子運輸中的功能角色。
蛋白質(zhì)-核酸相互作用的分析：用于研究DNA-蛋白質(zhì)和RNA-蛋白質(zhì)相互作用，包括轉錄因子與基因組特定位點的相互作用。
（數(shù)據(jù)來源 Yang X, et al. Plant Commun. 2020）
新的標志物或者靶點蛋白發(fā)現(xiàn)：鄰近標記技術可以用于研究藥物與其靶蛋白和RNA的相互作用，這對于藥物開發(fā)和靶標驗證非常重要。通過這種方法，可以確定藥物的直接作用靶點，以及藥物可能影響的信號通路和生物學過程。
E3泛素連接酶底物的鑒定：通過鄰近標記技術，可以鑒定E3泛素連接酶的底物，這對于理解藥物如何通過泛素-蛋白酶系統(tǒng)來調(diào)控蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和功能非常重要。
（數(shù)據(jù)來源 Huang HT, et al. Nat Chem Biol. 2024. ）
鄰近標記的重要技術考慮
?選擇合適的鄰近標記：在選擇用于特定類型實驗的最佳酶時，需要考慮不同酶的特性。例如，APEX和HRP需要特定的底物和H2O2，這限制了它們在動物體內(nèi)的應用。BioID和TurboID則因為其更高的催化活性和更快的動力學，更適合在動物體內(nèi)使用。
（數(shù)據(jù)來源 Cho KF, et al. Nat Protoc. 2020）
2. 通過實驗驗證與PL酶的融合不會破壞誘餌蛋白的天然功能和定位是至關重要的。
3. 為了產(chǎn)生誘餌-酶融合，首選內(nèi)源性基因組位點的CRISPR敲入或低滴度慢病毒遞送，而不是瞬時反式感染，以最大限度地減少因誘餌過表達而產(chǎn)生的偽影。
4. 輸入材料的數(shù)量（如細胞數(shù)量）和標記時間需要根據(jù)目標蛋白質(zhì)組的大小仔細衡量，以確保有足夠的生物素化材料用于高覆蓋深度的MS檢測。
