背景

穿孔蛋白的重組表達(dá)、分離及表征是用于理解其生物膜滲透特性的最常見策略之一，研究他們的技術(shù)之一就是將他們重組到極化的脂質(zhì)雙分子層中。常規(guī)的染色方法（如考馬斯亮藍(lán)染色）不夠敏感，無法檢測到樣本中存在的所有蛋白，獲得足夠活性以進(jìn)行重構(gòu)實(shí)驗(yàn)，同時(shí)純度足夠以顯示一致和可重復(fù)結(jié)果的樣本顯得尤為重要性。

2024年10月研究人員在nature protocols上發(fā)表了一篇名為“How to isolate channel-forming membrane proteins using the E. coli expression system”的文章，該文章描述了如何用大腸桿菌（Escherichia coli）BL21Gold（de3）ΔABCF菌株來優(yōu)化目標(biāo)蛋白的生產(chǎn)，并詳細(xì)描述了如何通過不同溶解度分離細(xì)菌組分，以及如何使用洗滌劑溶液提取目標(biāo)蛋白。此外，文章還介紹了如何通過離子交換色譜法提高蛋白純度，并將純化的蛋白插入外膜囊泡中以便于共純化。經(jīng)過優(yōu)化該方案可以適應(yīng)于分離受體、載體、泵或任何其它膜活性蛋白質(zhì)類。

大腸桿菌BL21Gold（de3）ΔABCF菌株的優(yōu)勢

該菌株通過基因工程敲除了OmpF、OmpC、LamB和OmpA這四個(gè)主要的外膜孔蛋白基因，從而減少了內(nèi)源性膜蛋白的表達(dá)。這有助于減少在純化目標(biāo)蛋白時(shí)的污染，提高目標(biāo)蛋白的純度。

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通道形成膜蛋白的表達(dá)純化

形成通道的膜蛋白主要有三大類：成孔毒素（PTFs），細(xì)胞壁通道蛋白，外膜蛋白（Omps），無論P(yáng)TFs的跨膜結(jié)構(gòu)域是基于α-螺旋還是β-片層，它們都可溶于無洗滌劑的緩沖液中。當(dāng)誘導(dǎo)劑的量、表達(dá)的長度和溫度得到優(yōu)化，PTFs可以在第一次超速離心后在上清液中收集。細(xì)胞壁通道蛋白，如MspA家族的通道，在短時(shí)間內(nèi)以類似的方式溶解；萃取后應(yīng)立即從PFTs等可溶性組分中純化，但純化緩沖液必須含有一些去污劑（例如，0.5%辛基- poe）。外膜蛋白和膜蛋白通常大多數(shù)最終會出現(xiàn)在包涵體中，必須從包涵體中提取出來，用合適的洗滌劑，在合適的溫度下，讓合適的顆粒重新懸浮一段時(shí)間。當(dāng)?shù)鞍自谏锨逡褐酗@示出清晰的條帶，可以使用色譜步驟進(jìn)行純化。

如果目的蛋白是天然表達(dá)于革蘭陰性菌外膜的通道形成膜蛋白，那么其活性很可能受到周圍脂多糖的影響。將omv融合到一個(gè)平面的雙層結(jié)構(gòu)中，使得我們可以對重組到其原生環(huán)境中的孔蛋白進(jìn)行表征。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)需要與omv共純化時(shí)，有幾個(gè)重要的細(xì)節(jié)需要考慮：首先該蛋白必須與與大腸桿菌分子機(jī)制相容的信號肽一起翻譯；其次該蛋白的表達(dá)必須誘導(dǎo)24小時(shí)，以刺激OMVs的產(chǎn)生；并且該菌株必須缺乏OmpA，其缺失是OMVs過量產(chǎn)生的特征。這將使產(chǎn)品的產(chǎn)量提高。

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膜通道蛋白表達(dá)純化問題和優(yōu)化策略

作者在表達(dá)和純化膜通道蛋白的過程中，遇到了一系列問題，同時(shí)也提出相應(yīng)的優(yōu)化策略來解決這些問題。

誘導(dǎo)表達(dá)的OD600：在對蛋白表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化時(shí)，建議嘗試不同的目標(biāo)OD600值，其中OD600是一個(gè)很好的起始點(diǎn)。在這個(gè)起始點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)在30℃的條件下以標(biāo)準(zhǔn)的誘導(dǎo)劑的量誘導(dǎo)后出現(xiàn)2種情況：

情況一：OD600不斷增長（如OmpE36），這種變化說明蛋白的表達(dá)對細(xì)菌的生長是無害的；

情況二：OD600減少，趨于平穩(wěn)，然后再次增長（如OprO/P）。這種情況說明蛋白表達(dá)對細(xì)菌的生長是有害的，這種時(shí)候可以調(diào)整其OD600誘導(dǎo)起始點(diǎn)，在低OD值下誘導(dǎo)較長時(shí)間或者在高OD值下誘導(dǎo)較短時(shí)間。并降低誘導(dǎo)量和誘導(dǎo)溫度（20℃）。

表達(dá)質(zhì)粒：若蛋白不表達(dá)，則質(zhì)粒和ORF存在問題，可以減少誘導(dǎo)劑，在較低的溫度下長時(shí)間誘導(dǎo)表達(dá)，或?qū)ζ滟|(zhì)粒進(jìn)行重新測序?？赏ㄟ^密碼子優(yōu)化來提高蛋白的表達(dá)。如果蛋白表達(dá)對宿主有毒性，例如pLysS表達(dá)使T7聚合酶失活的溶菌酶，可以增加誘導(dǎo)劑（IPTG高達(dá)2mM），在更高的OD下縮短表達(dá)時(shí)間。

表達(dá)溫度：誘導(dǎo)前，培養(yǎng)物可以在冰上冷卻15min，對于一些長表達(dá)或高表達(dá)的蛋白質(zhì)，降低表達(dá)溫度（不低于20℃）以獲得更好的折疊和更少的融入包涵體有利于外膜是有用的。

蛋白提取優(yōu)化策略：選擇適當(dāng)?shù)南礈靹┖蜐舛?，以幫助從膜組分中提取目標(biāo)蛋白。調(diào)整洗滌劑的濃度和提取時(shí)間，以優(yōu)化蛋白的溶解性和回收率。調(diào)整提取緩沖液的pH值和離子強(qiáng)度，以提高目標(biāo)蛋白的溶解性和穩(wěn)定性。

總結(jié)

該文章描述的方案為逐步優(yōu)化大腸桿菌重組體系中通道形成膜蛋白的表達(dá)、提取和純化條件提供了合理的策略。表達(dá)時(shí)間和溫度、誘導(dǎo)劑濃度、去垢劑性質(zhì)和濃度、孵育時(shí)間和純化pH均是可根據(jù)特定蛋白進(jìn)行優(yōu)化的參數(shù)。選擇了合適的誘導(dǎo)溫度誘導(dǎo)時(shí)間，以及合適的去污劑，未來就能更容易地提取蛋白質(zhì)。文章中提到的協(xié)議不僅適用于原核通道形成膜蛋白，還可以用于葉綠體、線粒體或一般真核生物的孔形成蛋白的生產(chǎn)。通過適當(dāng)?shù)膬?yōu)化，該協(xié)議也可以適應(yīng)于受體、載體、泵或其他任何膜活性蛋白的分離，從而為廣泛的生物醫(yī)學(xué)研究提供了一個(gè)強(qiáng)大的工具。