關(guān)鍵詞：重癥肌無力、MG、EAMG、實(shí)驗(yàn)性自身免疫性重癥肌無力、動物造模、自身免疫性疾病

為什么你的EAMG模型總是不穩(wěn)定？

重癥肌無力（Myasthenia Gravis, MG）是一種以肌肉無力為主要特征的自身免疫性疾病。實(shí)驗(yàn)性自身免疫性重癥肌無力（EAMG）作為研究MG發(fā)病機(jī)制和評估新療法的核心動物模型，已有超過50年的應(yīng)用歷史。然而，一個長期困擾研究者的難題始終存在：模型誘導(dǎo)成功率低、個體差異大、重復(fù)性差。

抗原來源不同、佐劑劑量不一、注射部位隨意——這些看似細(xì)微的差異，往往決定了實(shí)驗(yàn)的成敗。正如南京中醫(yī)藥大學(xué)團(tuán)隊(duì)在《International Journal of Molecular Sciences》最新發(fā)表的研究中所指出的：EAMG模型誘導(dǎo)長期以來缺乏標(biāo)準(zhǔn)化方案，嚴(yán)重制約了藥物篩選和機(jī)制研究的可重復(fù)性。

好消息是，這一問題終于有了系統(tǒng)性的解決方案。

一、痛點(diǎn)直擊：傳統(tǒng)EAMG造模的三大“坑”

坑1：動物品系選不對，努力全白費(fèi)

C57BL/6小鼠雖是免疫學(xué)研究的“標(biāo)配”，但在EAMG造模中卻常常“不給力”。研究發(fā)現(xiàn)，即便使用優(yōu)化的免疫方案，C57BL/6小鼠的臨床評分普遍低于2分（滿分4分），RNS陽性率不足50%，且小鼠體型小導(dǎo)致采血困難、注射部位難以操作。此外，C57BL/6小鼠攻擊性強(qiáng)，同籠打斗嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)后期動物狀態(tài)。

坑2：抗原佐劑“差不多就行”，結(jié)果差很多

傳統(tǒng)方案常用50 μg AChR肽 + 1 mg H37Ra，但這一組合在Lewis大鼠中往往不足以誘導(dǎo)穩(wěn)定的肌無力癥狀。癥狀出現(xiàn)晚（15-20天）、臨床評分低（多低于2分），模型成功率大打折扣。

坑3：注射部位隨意選，藥物吸收成問題

皮下注射后形成硬結(jié)、藥物吸收不良，是EAMG造模中最常見卻又最容易被忽視的問題。乳化時間過長導(dǎo)致乳劑過稠、注射部位過少導(dǎo)致局部藥物堆積——這些細(xì)節(jié)直接決定了免疫應(yīng)答的強(qiáng)度。

二、解決方案：四大優(yōu)化維度，讓EAMG造模從“玄學(xué)”變“科學(xué)”

南京中醫(yī)藥大學(xué)團(tuán)隊(duì)通過系統(tǒng)的單變量對照實(shí)驗(yàn)，在Lewis大鼠和C57BL/6小鼠中逐一驗(yàn)證了關(guān)鍵參數(shù)的影響，最終形成了一套高成功率、高重復(fù)性的標(biāo)準(zhǔn)化方案。

優(yōu)化1：動物選擇——Lewis大鼠是首選

結(jié)論：Lewis大鼠是EAMG造模的優(yōu)選品系。

優(yōu)化2：抗原佐劑劑量——加量不加“傷”

通過對比50 μg與75 μg AChR肽、1 mg與2 mg H37Ra的配伍效果，研究得出明確結(jié)論：

• AChR肽：75 μg > 50 μg。75 μg組臨床評分更高、癥狀出現(xiàn)更早（約第10天），部分大鼠評分可達(dá)3分以上（滿分4分），而50 μg組多數(shù)評分低于2分。

• H37Ra：2 mg > 1 mg。2 mg組AChR抗體水平顯著升高，提示更強(qiáng)的免疫應(yīng)答。

推薦方案：75 μg AChRα97-116肽 + 2 mg H37Ra（首次免疫，CFA為佐劑）。

優(yōu)化3：乳化與注射——細(xì)節(jié)決定成敗

乳化時間影響有限，但注射部位至關(guān)重要！

• 乳化時間：15分鐘與60分鐘的乳化時間對體重、臨床評分和炎癥因子水平無顯著影響，但短時間乳化可減少皮下結(jié)節(jié)形成。

• 注射部位增加足墊注射：包含足墊注射的組別癥狀出現(xiàn)更早、臨床評分更高、RNS衰減率更大、AChR抗體水平更高。

推薦操作：

• 使用無橡膠活塞的注射器進(jìn)行乳化，減少熱量產(chǎn)生，保護(hù)抗原完整性。

• 大鼠皮下注射使用22G針頭，小鼠及足墊注射使用25G針頭。

• 增加背部注射位點(diǎn) + 納入足墊注射，顯著改善藥物吸收。

• 注射后輕柔按壓，定期觀察，必要時使用碘伏消毒和紅霉素軟膏預(yù)防感染。

優(yōu)化4：術(shù)后護(hù)理——小細(xì)節(jié)，大不同

• 注射后按摩和熱敷可促進(jìn)藥物吸收、減少持續(xù)性結(jié)節(jié)形成。

• 將總劑量分散至更多注射位點(diǎn)、減少每點(diǎn)位注射體積，可降低結(jié)節(jié)形成風(fēng)險。

三、標(biāo)準(zhǔn)化造模方案（完整操作流程）

基于上述優(yōu)化，我們整理出經(jīng)過驗(yàn)證的EAMG標(biāo)準(zhǔn)化造模方案：

【材料清單】

【免疫方案】

首次免疫（第0天）：

• 配制200 μL乳劑：100 μL PBS（含75 μg AChR肽）+ 100 μL CFA（含2 mg H37Ra）

• 皮下多點(diǎn)注射：肩部、背部、尾根部

• 建議納入足墊注射

加強(qiáng)免疫（第30天）：

• 配制200 μL乳劑：100 μL PBS（含75 μg AChR肽）+ 100 μL IFA（不含H37Ra）

• 注射部位同首次免疫

四、模型評價體系：四大維度全面驗(yàn)證

成功造模后，需要通過多維度指標(biāo)進(jìn)行驗(yàn)證。通常采用臨床評分 + RNS + ELISA的組合評價體系。

維度1：Lennon臨床評分（核心指標(biāo)）

• 判定標(biāo)準(zhǔn)：臨床評分 > 2分為造模成功。

• 操作要點(diǎn)：將動物置于光滑表面，連續(xù)觀察約2分鐘，根據(jù)活動能力評分。若臨床表現(xiàn)介于兩級之間，可加0.5分。

維度2：重復(fù)神經(jīng)電刺激（RNS）

• 方法：第45天進(jìn)行RNS測試。將針灸針作為電極，插入坐骨神經(jīng)附近肌肉、腹部皮下、跟腱和腓腸肌內(nèi)側(cè)頭。

• 刺激參數(shù)：3 Hz和5 Hz，每組10個脈沖，共3組。

• 計算：衰減率D = [（第1個波幅 - 第5個波幅）/ 第1個波幅] × 100%

• 判定標(biāo)準(zhǔn)：D值 > 10%為陽性，提示肌力受損。

維度3：血清AChR抗體檢測（ELISA）

• 采血：第45天尾尖采血，室溫靜置30 min，3000 rpm、4℃離心15 min取血清。

• 檢測：ELISA法檢測抗AChR 97-116抗體滴度。

• 判定標(biāo)準(zhǔn)：模型組AChR-Ab水平顯著高于對照組。

維度4：炎癥因子檢測

• 指標(biāo)：IL-4、IFN-γ、IL-17等促炎因子。

• 方法：ELISA法檢測血清炎癥因子水平。

• 判定標(biāo)準(zhǔn)：模型組炎癥因子水平顯著上調(diào)。

【綜合評價標(biāo)準(zhǔn)】

造模成功 = 臨床評分 > 2分 + RNS衰減率 > 10% + AChR-Ab水平顯著升高。

五、方案優(yōu)勢總結(jié)

六、應(yīng)用場景與價值

這套標(biāo)準(zhǔn)化EAMG造模方案可廣泛應(yīng)用于：

1. 藥物篩選：評估免疫抑制劑、單克隆抗體、補(bǔ)體抑制劑等候選藥物的療效。

2. 機(jī)制研究：探索AChR抗體介導(dǎo)的自身免疫損傷機(jī)制。

3. 新療法驗(yàn)證：從B細(xì)胞耗竭療法到FcRn抑制劑，EAMG是臨床前研究的金標(biāo)準(zhǔn)模型。

4. 中藥研發(fā)：評估中藥復(fù)方對自身免疫性疾病的調(diào)節(jié)作用。

EAMG模型不穩(wěn)定的時代正在過去。南京中醫(yī)藥大學(xué)團(tuán)隊(duì)通過系統(tǒng)的單變量優(yōu)化研究，用數(shù)據(jù)告訴我們：標(biāo)準(zhǔn)化不是限制，而是解放——讓研究者從“碰運(yùn)氣”的造模中解脫出來，把精力真正投入到科學(xué)問題本身。

核心方案速記：雌性Lewis大鼠 + 75 μg AChRα97-116肽 + 2 mg H37Ra/CFA + 多點(diǎn)皮下注射（含足墊）+ 第30天加強(qiáng)免疫 + 臨床評分/RNS/ELISA多維評價 = 高成功率EAMG模型

參考文獻(xiàn)：

[1] Zhang X, Bai Y, Wang S, Shi J, Wu H. Optimization of Induction Protocols for Experimental Autoimmune Myasthenia Gravis. Int J Mol Sci. 2025;26(10):4628. Published 2025 May 12. doi:10.3390/ijms26104628.

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