小口徑血管移植物（內徑＜6 mm）的臨床缺口是心血管外科領域長期未解決的難題。自體血管取材有限、供區(qū)損傷風險高，而現(xiàn)有合成材料（如ePTFE）面臨持續(xù)炎癥、鈣化和內膜增生等問題，至今仍無理想的小口徑人工血管產品進入臨床。紅細胞膜囊泡（EMVs）因其良好的生物相容性和免疫逃逸特性，已被廣泛用于納米藥物遞送。然而，這一"don't eat me"策略僅利用了紅細胞膜的被動免疫屬性，其主動免疫調控潛力尚未開發(fā)。

磷脂酰絲氨酸（PS）是一種保守的凋亡信號分子，正常狀態(tài)下被限制在細胞膜內葉，一旦外翻至外葉，即成為巨噬細胞識別的"eat me"信號，啟動吞噬清除過程（即efferocytosis，胞葬作用）。華中科技大學研究團隊發(fā)表于《Nature Communications》的一篇文章提出了一種全新策略：通過磷脂酰絲氨酸外翻方法（PEM）制備PS外翻紅細胞膜囊泡（PS-EMVs），將其修飾于小口徑血管移植物表面，主動激活免疫胞葬通路，實現(xiàn)免疫調控介導的血管組織再生。

PS-EMVs的制備與表征

研究人員首先從兔全血中分離純化紅細胞，采用低滲處理結合超聲處理的磷脂酰絲氨酸外翻方法（PEM）制備PS-EMVs。透射電鏡（TEM）顯示，PS-EMVs呈標準納米囊泡形態(tài)，平均粒徑約134 nm，小于傳統(tǒng)機械擠出法（CEM）制備的EMVs（約230 nm）；兩者Zeta電位相近，均呈負電性。熒光共定位分析顯示，PS-EMVs中DiI信號與Annexin V-FITC標記的PS信號共定位率顯著高于EMVs。流式細胞術進一步定量顯示，約80.60%的PS-EMVs實現(xiàn)了PS外翻，遠超CEM制備的EMVs。

研究者還使用abinScience提供的Anti-Phosphatidylserine Reference Antibody (Bavituximab, RUO)（貨號 YP862016）對PS暴露進行高靈敏度的定量驗證，結果與Annexin V檢測一致，進一步確認了PS外翻的高效性。機制層面，ATP酶活性檢測顯示，PEM處理顯著降低了維持膜磷脂不對稱性的翻轉酶ATP11活性，這是PS強制外翻的核心機制。

Figure 1. 超細金屬顆粒(EMVs)和聚苯乙烯超細金屬顆粒(PS-EMVs)的制備與表征

PS-EMVs對促炎巨噬細胞的免疫調控

確認PS-EMVs的結構特征后，研究者在RAW264.7巨噬細胞模型中驗證其免疫調控功能。將DiI標記的PS-EMVs與EMVs分別加入巨噬細胞培養(yǎng)體系，熒光顯微鏡觀察顯示，巨噬細胞對PS-EMVs的吞噬速率從20分鐘至4小時持續(xù)增加，顯著高于EMVs組，證實PS外翻有效促進了胞葬攝取。

在LPS誘導的M1巨噬細胞模型中，PS-EMVs處理后，M1標志基因iNOS和IL-1β表達顯著下調，M2標志基因CD206和YM1表達顯著上調；ELISA檢測顯示促炎因子TNF-α分泌減少，抗炎因子IL-10分泌增加。Western blot分析進一步揭示，PS-EMVs能激活MerTK磷酸化并抑制NF-κB通路（p65磷酸化降低）；當用抗PS抗體封閉PS后，上述效應消失，證實PS-MerTK軸是調控炎癥的關鍵通路。

Figure 2. PS-EMVs對促炎巨噬細胞的免疫調節(jié)機制

PS-EMVs修飾小口徑血管移植物的構建

基于細胞水平驗證，研究人員進一步將PS-EMVs整合至可植入器械中。以聚己內酯（PCL）為基材，通過靜電紡絲制備小口徑管狀支架，依次經多巴胺（pDA）正電涂層修飾和PS-EMVs負電涂層吸附，最終獲得PS-EMVs修飾血管移植物（PEMVG）。SDS-PAGE蛋白譜分析顯示，PEMVG與EMVs修飾移植物（EMVG）蛋白組成高度一致。

熒光標記顯示PS-EMVs均勻分布于移植物表面，蛋白定量結果顯示每平方厘米吸附量約3.7 μg。體外循環(huán)系統(tǒng)模擬10天后，約10.91%的PS-EMVs仍保留于移植物表面，提示其具備持續(xù)信號釋放能力。四組移植物（PCL、pDAG、EMVG、PEMVG）爆破壓均遠超生理血壓范圍（90-120 mmHg），pDA涂層還顯著降低了BSA蛋白非特異性吸附并促進內皮細胞黏附。

Figure 3. 使用PS-EMVs(PEMVG)修飾的小直徑血管移植物的構建

兔頸動脈置換模型的體內評價

研究者選用兔頸動脈置換模型，對四種移植物進行為期3個月的體內評價。多普勒超聲隨訪顯示，PEMVG和EMVG組通暢率均為100%，顯著優(yōu)于pDAG（83.3%）和PCL（83.3%）。HE和Masson染色顯示，PEMVG組新生內膜致密、連續(xù)、均勻，厚度與天然血管相近；其他三組均呈現(xiàn)不均勻、松散的內膜結構。

免疫熒光染色顯示，PEMVG組CD31陽性內皮細胞覆蓋率顯著優(yōu)于其他組，α-SMA陽性平滑肌細胞層厚度與天然血管最為接近。補充分析還顯示PEMVG顯著降低M1巨噬細胞密度、提升M2巨噬細胞比例，并具有最強的抗鈣化效果。

Figure 4. 在兔子頸動脈中進行PEIMVG的原位植入

犬頸動脈模型的轉化前臨床評價

為評估臨床轉化潛力，研究人員建立了比格犬頸動脈置換模型，以商用ePTFE移植物為對照，進行為期6個月的系統(tǒng)評價。多普勒超聲顯示，兩組6個月通暢率均為100%，內徑變化差異不顯著。但在移植物取出后的精細分析中，PEMVG與ePTFE的差異明顯：H&E和Von Kossa染色顯示PEMVG管腔清晰無血栓、新生內膜均勻無鈣化，而ePTFE組存在明顯鈣化沉積。

免疫熒光共染（vWF/α-SMA）顯示PEMVG的內皮覆蓋率和平滑肌層厚度均優(yōu)于ePTFE。掃描電鏡（SEM）觀察到PEMVG內表面形成完整內皮形態(tài)，ePTFE內表面則存在明顯血小板黏附。Western blot定量分析顯示，PEMVG組M2/M1巨噬細胞比值更高，骨化相關蛋白Runx2和BMP2表達水平更低。

Figure 5. 犬類動物中PEMVG的臨床前轉化評估

單細胞RNA測序揭示胞葬調控機制

為在分子層面解析PEMVG的免疫調控機制，研究者對犬模型取出的移植物組織進行了單細胞轉錄組測序（scRNA-seq），整合分析共得到20,739個高質量單細胞轉錄組，涵蓋內皮細胞、平滑肌細胞、T細胞、B細胞、巨噬細胞等11種細胞類型。巨噬細胞亞群分析將其分為9個亞群（MP0-MP8）。與ePTFE組相比，PEMVG組中MP0亞群比例顯著升高。

KEGG通路富集分析顯示，MP0亞群高度富集溶酶體、胞葬、吞噬體及膽固醇代謝通路，其中胞葬通路位列前10。關鍵標志基因分析（C1QA、C1QB、C1QC、CD36、TIMD4、STAB1）證實MP0為胞葬功能高度活躍的巨噬細胞亞群。進一步分析顯示，MP0中IL-1β顯著下調、CD163顯著上調，提示該亞群具有強抗炎和促再生表型。LIPA、CD36、CTSS等關鍵基因在胞葬-吞噬體-溶酶體通路中的重疊表達，表明MP0介導了完整的序貫胞葬過程。

Figure 6. PEMVG通過單細胞RNA測序在血管重塑和再生過程中觸發(fā)胞葬作用

結論

本研究通過工程化手段實現(xiàn)了紅細胞膜磷脂酰絲氨酸的主動外翻，構建了具有高效胞葬誘導能力的生物界面。PEMVG移植物通過主動調控局部免疫微環(huán)境，成功解決了小口徑人工血管領域的血栓與鈣化難題，實現(xiàn)了從"免疫屏蔽"到"免疫調控再生"的轉變。該策略為心血管生物材料的設計提供了嚴謹?shù)睦碚撝闻c預臨床實驗依據(jù)。

abinScience實驗支持

abinScience為本研究提供了PS特異性抗體——Anti-Phosphatidylserine Reference Antibody (Bavituximab, RUO)（貨號 YP862016），用于流式細胞術定量評估PS-EMVs表面磷脂酰絲氨酸的暴露水平，為PS外翻效率的高靈敏度驗證提供了重要工具支撐。